复元胶囊对软骨细胞凋亡P38丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路的影响

【摘要】  目的： 观察复元胶囊含药血清对体外培养软骨细胞凋亡及P38丝裂原活化蛋白激酶信号通路（P38MAPK）的影响. 方法: 建立体外原代软骨细胞培养体系,制备复元胶囊含药血清,采用硝普钠（SNP）诱导软骨细胞凋亡，并用复元胶囊含药血清以及P38MAPK的特异阻断剂SB203580干预. 透射电镜观察软骨细胞凋亡的超微结构，流式细胞仪检测软骨细胞凋亡率的变化，比色法观察Caspase?3活性变化，免疫印迹技术（Western Blot）检测磷酸化P38, P53蛋白表达水平. 结果： ① 电镜下可观察到典型的凋亡细胞形态；② 中药组软骨细胞凋亡率（29.18±0.81）%比模型组（39.73±0.55）%显著降低，中药+抑制剂组软骨细胞凋亡率（25.85±0.85）%也比抑制剂组（27.27±0.78）% 低，差异均具有统计学意义（P<0.01，P<0.05）；③ 中药组凋亡执行因子Caspase?3的活性为（1.69±0.31） μg/μL，低于模型组（2.78±0.19） μg/μL，中药+抑制剂组（0.95±0.06） μg/μL与抑制剂组（1.17±0.13） μg/μL比较，Caspase?3的活性也降低，差异均具有统计学意义（P<0.01，P<0.05）；④ 中药组p?P38蛋白表达（0.84±0.06）与模型组（1.98±0.19）比较显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）；而中药+抑制剂组p?P38表达（0.32±0.03）与抑制剂组（0.36±0.04）比较无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）；⑤ P53蛋白在中药组（2.78±0.34）表达明显降低，与模型组（5.50±0.54）比较，差异均有统计学意义（P<0.01）；中药+抑制剂组（0.92±0.02）与抑制剂（1.41±0.09）组比较，P53蛋白表达也降低. 结论： 复元胶囊含药血清能通过抑制磷酸化P38表达、调节P38信号通路下游靶基因P53和凋亡执行因子Caspase?3而抑制SNP诱导的软骨细胞凋亡.

【关键词】  软骨细胞；细胞凋亡；P38丝裂原活化蛋白激酶类；复元胶囊

　　0引言

　　软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞，在软骨形成、代谢以及修复中起着极其重要的作用［1］. 在骨关节炎病变过程中软骨细胞凋亡已被认为是关节软骨退行性改变的病理因素之一［2-3］. 在NO供体硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）诱导的软骨细胞凋亡信号传导过程中, P38 MAPK信号通路参与了凋亡信号的转导［4］. 但目前国内外从信号转导的角度研究药物骨关节炎的报道尚少. 复元汤是由晒参、淫羊藿、鹿茸、黄芪、川芎、当归、枸杞子、三七等组成，是临床上长期用于治疗骨关节炎并有明显疗效的实验制剂. 本实验建立软骨细胞体外培养体系，观察复元胶囊含药血清对SNP诱导的软骨细胞凋亡的影响，并从信号转导的角度探讨其作用机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料雄性3 wk龄清洁级SD大鼠10只，平均体质量（50±5） g；雄性成年普通级SD大鼠20只，平均体质量（220±10） g（由重庆医科大学实验动物中心提供）. 复元胶囊由晒参、淫羊藿、鹿茸、黄芪、川芎、当归、枸杞子、三七等组成，委托重庆希尔安药业有限责任公司制成胶囊，仅供实验使用. SNP粉针剂（批号：H111021635，北京双鹤医药技术有限责任公司）；FD（F12∶DMEM=1∶1）培养基、优级胎牛血清（美国Hyclone公司）；Ⅱ型胶原酶（美国Sigma公司）；胰蛋白酶（美国Gibic公司）；总蛋白提取试剂盒（升博生物公司）；P38MAPK抑制剂SB203580（中国上海康成生物公司）；Annexin V?FITC试剂盒(中国晶美生物工程有限公司)；Caspase?3比色法检测试剂盒（美国Bio Vision公司）；磷酸化抗体P38(美国cell signaing公司)；P53抗体、蛋白内参β?actin(美国Santa Cruz公司)；PBS缓冲液、辣根酶标记兔抗山羊IgG（中国北京中衫生物技术有限公司）；免疫印迹化学发光试剂（中国碧云天生物公司）；PVDF膜（美国Millipore公司）；SW?CJ?2A型净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；2001?13型二氧化碳培养箱（上海常思工贸有限公司）；CK?2型倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司）；7500型透射电镜（日本HITACHI公司）；FACS Aria型流式细胞分析仪（美国BD公司）；凝胶成像仪（美国BioRad公司）；ELX800型酶标仪（德国Gene公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1软骨细胞的分离、培养及传代参照文献［5］的方法， 将大鼠断颈处死后，无菌条件下分离股骨头，浸入含青霉素和链霉素的双抗水中漂洗3次， FD培养基中漂洗3次；将软骨剪成1 mm3大小，移入2.5 g/L胰蛋白酶中，37℃水浴箱中消化30 min；胎牛血清终止消化，PBS缓冲液清洗2遍；再加入2 g/L Ⅱ型胶原酶，37℃水浴箱消化，每30 min轻轻摇荡1次，4 h后消化成絮状；1000 r/min离心5 min，弃上清，PBS缓冲液清洗2遍；加入含150 mL/L胎牛血清的FD培养基制成细胞悬液，用200目不锈钢筛网过滤后接种于培养瓶中，置于37℃,50 mL/L CO2培养箱进行原代培养. 倒置显微镜下观察细胞长满80%后传代培养，Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色鉴定细胞.

　　1.2.2含药血清的制备〗雄性成年SD大鼠20只，随机分为复元胶囊组（10只）和对照组（10只）. 复元胶囊组按Meeh?Rubner氏［6］公式给予10倍等效剂量药物，充分溶于生理盐水后灌胃；对照组给予等体积的生理盐水灌胃，每日2次，连续3 d. 末次灌胃后2 h心脏取血，4℃静置过夜，3000 r/min离心20 min，取上清，经0.22 μm抽滤除菌后,分装,-20℃保存备用.

　　1.2.3实验分组实验分为正常组（含150 mL/L胎牛血清的FD培养基正常培养）、模型组（2 mmol/L SNP+FD培养基）、空白血清组（2 mmol/L SNP+含100 mL/L空白血清的FD培养基）、中药组（2 mmol/L SNP+含100 mL/L复元胶囊含药血清的FD培养基）、抑制剂组（2 mmol/L SNP+50 μmol/L SB203580+无血清的FD培养基，预先用SB203580孵育1 h，再加入SNP和培养基）、中药+抑制剂组（2 mmol/L SNP+50 μmol/L SB203580+含100 mL/L复元胶囊含药血清的FD培养基，预先用SB203580孵育1 h，再加入SNP和培养基）.

　　1.2.4透射电镜形态观察将SNP诱导的软骨细胞用2.5 g/L胰酶消化后进行收集，2000 r/min 4℃离心成细胞团块，用25 g/L的戊二醛固定2 h,10 g/L四氧化锇再固定1.5 h，经梯度丙酮脱水，环氧树脂浸透包埋，超薄切片机切片，染色，HITACHI?7500型透射电镜下观察.

　　1.2.5流式细胞分析法检测细胞凋亡选用第2代软骨细胞，2×105个/mL密度种植于6孔培养板中. 培养24 h细胞贴壁后，除正常组外，用不含血清的FD培养基继续培养24 h使细胞同步化. 按1.2.3所述进行分组、处理，继续培养48 h后，收集培养上清和胰酶消化的细胞，离心后按FITC AnnexinV/PI试剂盒说明进行操作，采用FACS Aria流式细胞分析仪检测，每个样本检测计数的细胞数量均固定为10 000个，应用CEL LQuest软件获取、分析输出实验数据.

　　1.2.6比色法检测Caspase?3活性选用第2代软骨细胞，2×105个/mL密度种植于6孔培养板中. 培养24 h细胞贴壁后，除正常组外，用不含血清的FD培养基继续培养24 h使细胞同步化. 按1.2.3 所述进行分组、处理，继续培养48 h. 参照试剂说明书，分组提取总蛋白，采用Bradford法［7］测定蛋白浓度. 取50 μL含100 μg蛋白的细胞裂解上清（如体积不足50 μL，用Lysis Buffer补足）置于96孔板中，加入50 μL的2×Reaction Buffer，再加入5 μL 4 mmol/L的DEVD?ρNA Substrate并于37℃水浴箱中避光孵育2 h，用ELX800型酶标仪在λ=405 nm测定其吸光度值,根据其A值换算成每微升所含Caspase?3的质量. 每组设4个复孔.

　　1.2.7Western Blot检测磷酸化P38 MAPK激酶、P53蛋白表达选用第2代软骨细胞，2×105个/mL密度种植于6孔培养板中. 培养24 h细胞贴壁后，除正常组外，用不含血清的FD培养基继续培养24 h使细胞同步化. 按1.2.3所述进行分组、处理，继续培养48 h. 参照试剂说明书，分组提取总蛋白，采用Bradford法［7］测定蛋白浓度. 在BIO?RAD凝胶成像仪下暴光显影，观察拍照. 用Quantity One凝胶图像分析软件检测各组目的蛋白及其内参蛋白的吸光度值，两者的比值，以此作为各组蛋白的相对表达量. 重复4次.

　　统计学处理：统计分析采用SPSS10.0统计软件处理，各组数据以x±s表示，组间比较用One?Way ANOVA方差分析，多重比较采用SNK?q检验.

　　2结果

　　2.1透射电镜下软骨细胞凋亡的形态学变化凋亡以早期为主，镜下可见软骨细胞体积缩小,细胞膜完整，细胞表面的微绒毛明显减少，甚至消失，细胞浆致密，细胞器完整，核染色质浓缩，集聚于核膜下（图1A). 也可见中晚期凋亡细胞，细胞体积明显缩小，核膜发生皱褶，胞质密度增高,有典型的凋亡小体，内有细胞器,细胞周围可见脱落的凋亡小体（图1B）.

　　2.2复元胶囊含药血清对软骨细胞凋亡和Caspase?3活性的影响与模型组和空白血清组比较，中药组细胞凋亡率明显降低，Caspase?3活性抑制，差异有统计学意义（P<0.05）；使用SB203580阻断P38信号通路后，抑制剂组与模型组比较，凋亡率显著降低，伴有Caspase?3活性抑制（P<0.01），而抑制剂与含药血清合用后，与抑制剂组比较，细胞凋亡率也下降，Caspase?3活性抑制，差异有统计学意义（P<0.05，表1）.

　　2.3复元胶囊对软骨细胞p?P38和P53蛋白表达的影响结果如图2所示，与模型组和空白血清组比较，中药组能抑制p?P38和P53的表达，其差异有显著统计学意义（P<0.01）.SB203580抑制p?P38后，p?P38表达明显减少，其下游基因P53表达也减少，与模型组比较，差异具有显著统计学意义（P<0.01）. 当抑制剂与中药联合使用时，与抑制剂组比较，p?P38表达无明显减少（P>0.05），而P53表达明显减少（P<0.01，表2）.

　　A： 早期； B： 中晚期.

　　图1软骨细胞凋亡形态TEM ×10 000（略）

　　表1复元胶囊含药血清对软骨细胞凋亡和Caspase?3活性的影响（略）

　　aP<0.05， bP<0.01 vs 模型； cP<0.05 vs 抑制剂; dP<0.01 vs 空白血清.

　　1： 正常组；  2： 模型组； 3： 空白血清组； 4： 中药组； 5： 抑制剂组； 6： 中药+抑制剂组.

　　图2磷酸化P38，P53蛋白的Western Blot检测结果（略）

　　表2复元胶囊对软骨细胞p?P38和P53蛋白表达的影响（略）

　　aP<0.05， bP<0.01 vs 模型； cP<0.05 vs抑制剂; dP<0.01 vs空白血清.

　　3讨论

　　复元胶囊具有补益肝肾、益气活血之功效，可通过调节软骨中基质金属蛋白酶和组织型金属蛋白酶抑制剂［8］、白介素?1β和转化生长因子β2［9］的平衡而减轻兔膝骨关节炎软骨的退变. 本实验从复元胶囊对软骨细胞凋亡及P38信号转导通路的角度进一步探讨其作用机制.

　　骨关节炎病变过程中有软骨细胞凋亡的特征性形态，细胞凋亡率显著上升［2-3］. 本实验中SNP诱导的软骨细胞在透射电镜下可观察到典型的凋亡形态，包括细胞体积缩小、染色质凝聚、核碎片、细胞皱缩、凋亡小体等.

　　我们发现，P38信号转导通路在SNP诱导的软骨细胞凋亡过程中激活，其下游基因P53表达同步增加，Caspase?3活性增强. 应用复元胶囊含药血清作用于SNP诱导的软骨细胞后，磷酸化P38蛋白表达显著降低，伴随有P53表达下降和Caspase?3活性抑制，同时，细胞凋亡率明显下降，而空白血清组无明显变化. 这提示复元胶囊能有效的抑制SNP诱导的软骨细胞中p?P38的表达和活化，进而抑制SNP诱导的软骨细胞凋亡. 既往研究发现，P38通过磷酸化IKK（IκB的一个上游激酶）和磷酸化P53的丝氨酸15残基，稳定P53蛋白，使其含量增加［10］. 阻断P38信号通路后，下游与调节细胞增殖、细胞凋亡相关的基因如P53,Caspase?3,Bax,Bcl?2等的表达紊乱，从而对细胞凋亡有抑制作用［11］. 本实验结果提示复元胶囊抑制SNP诱导的软骨细胞凋亡可能的机制是通过抑制p?P38的表达和活化，引起其通路下游与细胞凋亡相关基因如P53, Caspase?3等的表达或活性降低，进而减少细胞的凋亡.

　　但是，当用P38的特异性抑制剂SB203580阻断P38信号通路后，软骨细胞的凋亡率降低. SB203580和复元胶囊含药血清联合使用时，与抑制剂组比较，其凋亡水平下降，P53表达减少，Caspase?3活性明显降低，而p?P38表达无明显变化，表明复元胶囊含药血清可能还通过其它信号通路如ERK1/2, NF?κB等抑制SNP诱导的软骨细胞凋亡，通过几条通路共同作用或者相互作用，发挥自身独特的多靶点效应，还有待进一步研究.

【】
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