蛋白激酶C在大鼠重症急性胰腺炎中的表达
作者：王斌生,曹农,柴琛,俞永江,武光
【摘要】 目的: 探讨蛋白激酶C(PKC)家族成员PKCα和PKCδ在重症急性胰腺炎(SAP)大鼠胰腺及肺脏中的动态表达情况和组织病理改变的关系. 方法： 胰胆管逆行注射牛黄胆酸钠制成大鼠SAP模型，观察胰腺及肺脏病变化，采用免疫组织化学方法分别检测PKCα，PKCδ在SAP大鼠胰腺和肺脏中的表达情况,并进行对比分析. 采用逆转录?多聚酶链反应（RT?PCR）检测96只大鼠胰腺组织中PKC mRNA的表达情况. 结果： 建模后1，6，12和24 h假手术（SO）组胰腺中PKCα表达分别为0.70±0.04，0.71±0.05，0.75±0.04和0.71±0.07；SAP组分别为0.83±0.05, 0.95±0.09, 1.10±0.10和1.08±0.16，两组各时间点之间差异均有统计学意义（P<0.01）. 轻型急性胰腺炎（MAP）组大鼠建模后胰腺中PKCα表达分别为0.73±0.04, 0.73±0.03, 0.85±0.08和0.84±0.06，与SO组各时间点相比，在12 h和24 h差异具有统计学意义（P<0.05），与PKCα相类似，PKCδ的表达在1 h开始增高，12 h达到高峰，且维持时间较长. MAP组PKCδ在12 h达到高峰，但维持时间较短，24 h时有所减低. 结论： PKCα在SAP的病程中起重要作用. 监测PKCα水平可为SAP的早期诊断提供帮助.
【关键词】 胰腺炎;信号传导;蛋白激酶C;逆转录聚合酶链反应
0引言
近年来,重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP)的研究多集中在炎症因子通过信号传导引发全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS) ,并渐进发展成为多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrame, MODS)上，但对于SAP的早期诊断仍缺乏特异性指标. 已有研究［1-2］证实蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)可调控多种促炎因子（IL?1,IL?12,TNF和NF?ΚB等）的活化，测定血清IL?12水平能预测SAP的预后，对其早期诊断具有重要意义［3］. 我们采用免疫组织化学法和RT?PCR法测定PKC在SAP中的表达水平，以探讨PKC在SAP中的作用机制，为临床诊治SAP提供依据.
1材料和方法
1.1材料清洁级SD大鼠96只（雌雄各半），体质量220～260 g，（甘肃省中医学院实验动物中心），实验前12 h禁食，自由饮水. 牛黄胆酸钠(美国Sigma公司)；一步法总RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogen公司)；一步法反转录聚合酶链式反应(RT?PCR)试剂盒（大连宝生物公司）；即用型 SABC免疫组化染色试剂盒，兔抗 PKCα，鼠抗 PKCδ和DAB显色试剂盒(武汉博士德公司).
1.2方法
1.2.1实验分组96只SD大鼠随机分为假手术(sham operation，SO)组、轻型急性胰腺炎（mild acute pancreatitis，MAP）组和SAP组，每组动物32只.
1.2.2模型制作MAP组大鼠术前禁食12 h，自由饮水,戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔麻醉,无菌条件下上腹正中切口进腹,于十二指肠内侧见片状分布的胰腺,肝门部胆胰管用无损伤动脉夹夹闭,从胆胰管开口十二指肠系膜缘对侧肠壁穿刺插入导管,导管进入肠腔后对准膨大壶腹中心插入胆胰管约1 cm,用微量泵以0.1 mL/min速度推注20 mL/L牛磺胆酸钠1 mL/kg,推注完毕后无损伤动脉夹夹闭胰胆管壶腹部观察10 min后拔管,去除动脉夹,缝合十二指肠穿刺口并关腹. SAP组用微量泵以0.1 mL/min速度推注50 mL/L牛磺胆酸钠1 mL/kg, 其余步骤同MAP组. SO组开腹仅轻轻翻动胰腺，关腹后皮下注射40 mL/kg生理盐水.
1.2.3取材和评分各组动物在建模后于 1，6，12和24 h四个时间点，（各时间点8只动物）以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经原切口入腹，无菌条件下取胰腺和肺脏，分别保存于40 g/L甲醛及-80℃冰箱，按［4］的方法，由病理医师对大鼠胰腺及肺脏组织在光镜下按水肿、出血、感染和坏死四方面的轻重程度进行盲法病理评分.
1.2.4免疫组织化学染色切片脱蜡至水，pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，室温下3 g/L H2O2孵育30 min，山羊血清封闭背景，加兔抗 PKCα多克隆抗体及鼠抗 PKCδ mAb（1∶50） 4℃过夜，滴加二抗 37℃孵育1 h，加链酶亲和素?生物素?过氧化物酶复合物，室温孵育1 h，DAB显色，苏木素复染细胞核，乙醇脱水. 阴性对照以 PBS代替一抗.1.2.5RT?PCR检测取组织100 mg匀浆后加入1 mL总RNA提取试剂，抽提组织总RNA，紫外分光光度仪测定标本RNA纯度，以甘油醛?3?磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参照扩增 PKCα及 PKCδ. 所有引物均由上海生物工程公司合成，PKCα引物序列: 上游5′gggatgaaatgcgacacc 3′，下游 5′ctctgagacgccgaagga 3′, 退火温度 56℃，共循环30次，产物长度300 bp；PKCδ引物序列：上游5′ctgtggcactttgctctg 3′下游 5′ttctgggtcacttggttc 3′退火温度 54℃，共30个循环，产物长度 153 bp；内参照 GAPDH引物序列：上游 5′tacagatcacgaaagcatagagga 3′下游 5′tccattcgttcctgaacagcgaca 3′退火温度 54℃，共30个循环，产物长度411 bp；取RT?PCR扩增产物4 μL,加上样缓冲液1 μL，在15 g/L琼脂糖凝胶上电泳，电泳条件为电压100 V, 60 min，凝胶图像分析系统分析，以目的基因与内参照GAPDH产物比值代表该样品PCR产物的相对含量.
统计学处理：采用SPSS11.5统计软件进行数据的统计分析，各组计量资料以x±s表示，组间比较用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义.
2结果
2.1大鼠胰腺和肺脏组织中PKC阳性细胞的表达SO组中可偶见PKCα和PKCδ阳性细胞，且主要在细胞浆中表达. MAP组PKCα和PKCδ阳性细胞在胰腺和肺泡胞浆及胞膜中均有表达. SAP组PKCα和PKCδ在胰腺及肺泡细胞膜中表达均呈强阳性. SAP组1，6，12和24 h四个时间点PKCα表达分别为 766.00±9.79，799.13±12.80，821.38±15.81和816.13±24.48；PKCδ表达分别为747.14±10.23，775.91±14.30，797.50±11.32和794.35±14.71，较 SO组明显升高，而MAP组低于 SAP组，三组各时间点差异均具有统计学意义（P<0.05）. MAP组中PKCα和 PKCδ于6 h开始升高，12 h达到高峰，此后有所下降. SAP组 PKCα和 PKCδ于1 h即开始升高，12 h达到高峰(图1，2).
2.2PKCα mRNA，PKCδ mRNA的表达水平结果显示，RT?PCR所得到的PKCα，PKCδ和 GAPDH产物长度分别为PKCα 300 bp，PKCδ 153 bp和GAPDH 411 bp. PKCα mRNA和PKCδ mRNA表达量MAP组高于 SO组，SAP组高于MAP组，三组间各时间点差异具有统计学意义（P<0.05，表 1，图3).
A： SO组； B： MAP组； C： SAP组.
图124 h PKCα在大鼠胰腺中的表达SABC ×400（略）
A： SO组； B： MAP组； C： SAP组.
图224 h PKCδ在大鼠肺脏中的表达SABC ×400（略）
表1RT?PCR法检测胰腺中PKCα mRNA，PKCδ mRNA表达（略）
aP<0.05, bP<0.01 vs SO; dP<0.01 vs MAP. SO: 假手术; MAP: 轻型急性胰腺炎; SAP: 重症急性胰腺炎.
M: marker； 1～4: SO组1,6,12,24 h； 5～8: MAP组1,6,12,24 h； 9～12: SAP组1,6,12,24 h. A: 各组胰腺组织中PKCα和GAPDH的RT?PCR产物电泳结果； B: 各组胰腺组织中PKCδ和GAPDH的RT?PCR产物电泳结果.
图3各组胰腺组织中的RT?PCR产物电泳图（略）
3讨论
PKC调控炎症因子的作用近年来逐渐受到重视. Lallena等［5］研究发现在静息细胞内,PKC与IκB激酶相结合,PKC是IκB激酶的直接激活剂,推测PKC很可能激活I?κB的激酶,后者使IκB磷酸化而与NF?κB解离,同时激活NF?κB. PKC在TNFα信号转导中起关键作用, TNFα可通过磷脂酶产生脂质第二信使,并引发一系列信号转导. 刘刚等［6］发现急性胰腺炎患者血中PKC的水平明显较对照组增高，这与我们的研究结果相一致. Miriam Horovitz?Fried的研究指出抑制PKCδ会减少IκB的磷酸化和NF?κB的激活，进一步减少炎症因子的释放，而且 PKCα可以影响 PKCδ的表达［7］. 我们的实验结果提示，在造模后各组间 PKCδ变化略慢于PKCα，强度上也弱于 PKCα,我们推测PKCδ可能在SAP发病的早期过程中并不起主要作用. 我们观察到SAP组PKCα的激活较早，而且24 h仍维持较高水平，MAP组PKCα在12 h才开始升高，且活性变化有自限性. 据此我们推测: MAP早期PKCα不激活或者激活很少，从而不会引发SIRS反应，在SAP发生早期，大量激活的PKC引起炎症因子的级联瀑布效应导致全身感染是SAP患者死亡的主要原因. 因此，PKCα的监测可以较早的反映SAP病程的进展，PKCα或许可以成为SAP早期诊断的指标. 另外，PKC抑制剂在一些炎症性疾病中起作用，有研究［8］表明蛋白激酶抑制剂可以减轻重症胰腺炎肺损伤程度，这些可能与PKC对中性粒细胞的调节相关联. 有关抑制PKC是否有治疗重症胰腺的作用有待进一步研究.
【】
［1］ 王孝养，熊维宁，徐永健，等. 核因子κB和蛋白激酶C对哮喘Th类细胞因子表达的调控［J ］. 中华结核和呼吸杂志，2001, 24(6): 355-359.
［2］ Tando Y, Algul H , Wagner M, et al. Caerulein?induced NF?kappa B/Rel activation requires both Ca2+ and protein kinase C as messengers［J］. Am J Physiol, 1999, 277:678-686.
［3］ 马东瑞，李伟，张晓华，等. 白介素IL?2与大鼠急性坏死性胰腺炎严重程度的关系［J］. 第四军医大学报，2005,26(20):1885-1887.
［4］ 秦兰芬，吴建新，袁耀宗，等. 大鼠急性坏死型胰腺炎病理特征评定方法的研究［J］. 实验动物学报，2002,10(4):210-213.
［5］ Lallena MJ, Diaz Meco MT, Bren G, et al. Activation of IkappaB kinase beta by protein kinase C isoforms［J］. Mol Cell Biol, 1999 ,19(3):2180-2188.
［6］ 刘刚，周朝霞，姬新才，等. 急性胰腺炎患者血浆D?二聚体含量及外周血淋巴细胞蛋白激酶C活性的变化及意义［J］. 中国急救医学，2005, 25(18):550-553.
［7］ Horovitz?Fried M, Sampson SR. Involvement of PKC alpha in insulin?induced PKC delta expression: Importance of SP?1 and NFkappaB transcription factors［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2007,352(1):78-83.
［8］ Shi C, Zhao X, Wang X, et al. Potential effects of PKC or protease inhibitors on acute pancreatitis?induced tissue injury in rats［J］. Vascul Pharmacol, 2007,46(6):406-411.
