过氧亚硝基阴离子调控谷氨酸脱氢酶的催化功能

【摘要】  目的： 观察过氧亚硝基阴离子（ONOO-）对谷氨酸脱氢酶（GDH）的硝基化修饰及功能调控. 方法： GDH与ONOO-体外反应，测定酶活性及别构调节效应，Western Blot检测GDH硝基化修饰；制备含“去硝基化酶”的脾脏蛋白，观察能否逆转ONOO-作用. 结果： 4~12 μmol/L ONOO-不影响GDH活性和二磷酸腺苷(ADP)别构激活作用，但使三磷酸鸟苷（GTP， 10 μmol/L）别构抑制作用由（49±4）%降低至（69±7）%和（75±3）%；36~108 μmol/L ONOO-使GDH活性由（0.81±0.05） kat/kg降低至（0.55±0.06）和（0.29±0.07） kat/kg，使GTP（10 μmol/L）别构抑制作用降低至（83±4）%和（95±7）%；324 μmol/L ONOO-使GDH完全失活. Western Blot检测到ONOO-使GDH发生硝基化修饰．脾脏蛋白可部分逆转上述作用. 结论： ONOO-可通过硝基化修饰调控GDH催化功能.

【关键词】  谷氨酸脱氢酶；过氧亚硝酸；酪氨酸硝基化修饰；别构调节

　　0引言

　　谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GDH）催化L?谷氨酸与α?酮戊二酸相互转化，是联系氨基酸和糖代谢的枢纽. GDH在细胞内可能会发生酪氨酸硝基化修饰［1］，但该修饰对酶催化功能的影响尚少见报道. 鉴于体内蛋白硝基化主要通过过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite, ONOO-)介导［2］，同时GDH催化功能被别构激活剂二磷酸腺苷(adenosine 5′?diphosphate, ADP)和抑制剂三磷酸鸟苷（guanosine 5′?triphosphate, GTP）调节［3］，本研究观察ONOO-对GDH催化活性和别构调节的影响.

　　1材料和方法

　　1.1材料牛肝脏GDH纯酶（Type I, ammonium sulfate suspension, ≥40 units/mg protein），还原型辅酶I（β?NADH），α?酮戊二酸，脂多糖(from Escherichia coli 055:B5) (美国Sigma公司)；抗硝基化蛋白mAb(anti?nitrotyrosine, anti?NT，美国Cayman Chemical公司)；硫酸铵，ADP，GTP(美国Amresco公司)；SmartSpec 3000型分光光度计(美国Bio?rad公司).

　　1.2方法

　　1.2.1ONOO-合成与定量硝酸化的双氧水与亚硝酸钠，以三通管迅速推入氢氧化钠溶液，得黄色产物，以消光系数1.670 (mmol/L)-1 ·cm-1定量［4］.

　　1.2.2GDH与ONOO-反应GDH透析除去硫酸铵，蛋白浓度调整为0.2 mg/mL，取300 μL置于1.5 mL离心管，另取1 μL ONOO-置于离心管内壁，使反应体系中ONOO-的终浓度为0，4，12，36，108和324 μmol/L，快速震荡10 s，加入300 μL缓冲液终止反应，立即进行酶活性测定和硝基化修饰检测.

　　1.2.3GDH催化活性测定按照［5］的方法进行测定，反应体系为250 μL，包含50 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.4), 50 mmol/L硫酸铵, 160 μmol/L β?NADH, 5 mmol/L α?酮戊二酸和5 μL GDH酶溶液；记录3 min内340 nm吸光度改变量. 以β?NADH的消光系数6.22 (mmol/L)-1·cm-1底物消耗速率，由公式［(△A 340 nm/min)/6.22］×250 μL×10-3÷0.5 μg计算每1 μg GDH每分钟转换底物的速度，每分钟转换1 μmol底物定义为1单位，将单位值折算为比催化活性kat/kg.

　　1.2.4GDH别构调节效应测定为测定ADP的别构激活效应，在反应体系中加入新鲜配置的ADP，使其终浓度为300 μmol/L，并以氢氧化钠调整pH 8.0, 然后测定GDH催化活性；为测定GTP的别构抑制效应，在反应体系中加入10 μmol/L GTP，然后测定GDH催化活性［5］.

　　1.2.5Western Blot检测GDH硝基化修饰ONOO-处理后的GDH立即进行SDS?PAGE分离，每泳道上样量为50 ng；其中一块凝胶用于银染以确保上样量一致，另一块凝胶进行湿法转膜，硝酸膜用50 g/L脱脂奶粉封闭1 h后，与anti?NT（1∶5000）反应过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶10 000）进行检测.

　　1.2.6脾脏蛋白对GDH修饰的影响按照参考文献［6］的方法制备脾脏蛋白，雄性SD大鼠，腹腔注射脂多糖20 mg/kg，24 h后，取脾脏，以Tris?HCl(pH 7.4)匀浆，105 000 g离心，1 h，保留上清得脾脏蛋白，其中含有较高浓度的“去硝基化酶”［6］. ONOO-处理后的GDH,蛋白浓度调整为0.01 mg/mL，与等体积的脾脏蛋白（6 mg/mL）室温反应2 h，取 50 μL与等体积的2×电泳上样缓冲液混合，每泳道上样20 μL，进行Western Blot 检测硝基化修饰的改变，同时取50 μL检测催化活性. 作为对照，将脾脏蛋白煮沸5 min，以灭活“去硝基化酶”，进行平行实验. 以上实验均重复6次.

　　统计学处理：计量数据以x±s表示，以SPSS13.0软件包进行方差分析(ANOVA)，多重比较采用Student?Newman?Keuls检验法.

　　2结果

　　2.1ONOO-对GDH催化活性和别构调节的影响ONOO-在4~12 μmol/L时不影响GDH催化比活性，但在36~108 μmol/L时，可显著抑制其催化比活性(P<0.01 vs 对照组). 在324 μmol/L时，GDH被完全灭活，其活性检测不到．GDH可被别构激活剂ADP激活2.58倍,该效应不受ONOO-影响，但是GTP的别构抑制效应则显著降低(4~108 μmol/L vs 对照组，P<0.01). 含有“去硝基化酶”的脾脏蛋白，可部分逆转36 μmol/L ONOO-对GDH催化比活性的抑制作用，但是对于108 μmol/L ONOO-处理的样品和完全失活的GDH则没有作用. 经过煮沸灭活“去硝基化酶”，脾脏蛋白的作用则完全消失（表1）.

　　表1ONOO-对GDH活性的影响及脾脏蛋白的逆转作用（略）

　　bP<0.01 vs 对照.

　　2.2ONOO-导致GDH发生硝基化修饰 0 μmol/L ONOO-处理的GDH与anti?NT抗体不发生反应（泳道1），而4～324 μmol/L ONOO-处理的GDH可被anti?NT抗体识别，并且免疫反应的信号强度随ONOO-浓度增加而增大（泳道2~6，图1）.

　　1： 0 μmol/L ONOO-； 2~6： 4，12，36，108，324 μmol/L ONOO-.

　　图1Western Blot 法检测ONOO-导致的GDH硝基化修饰（略）

　　2.3脾脏蛋白可部分逆转ONOO-对GDH的硝基化修饰4~36 μmol/L ONOO-处理的GDH与anti?NT抗体发生免疫反应（泳道1，4，7），样品经脾脏蛋白处理后，免疫信号被部分逆转（泳道2，5，8），而煮沸灭活的脾脏蛋白则不影响免疫反应强度（泳道3，6，9）（图2A）. 0 μmol/L ONOO-处理的GDH不与anti?NT 反应（泳道1），同时加入脾脏蛋白也不与anti?NT反应（泳道2和3），而108，324 μmol/L ONOO-处理的GDH与anti?NT有明显的反应条带（泳道4和7），脾脏蛋白（泳道5和8）不能逆转这种反应，煮沸的脾脏蛋白（泳道6和9）也没有作用（图2B）.

　　A： 1，4，7: 4，12，36 μmol/L ONOO-； 2，5，8: 4，12，36 μmol/L ONOO- +脾脏蛋白； 3，6，9: 4，12，36 μmol/L ONOO- +煮沸的脾脏蛋白. B： 1，4，7: 0，108，324 μmol/L ONOO-； 2，5，8: 0，108，324 μmol/L ONOO- +脾脏蛋白； 3，6，9: 0，108，324 μmol/L ONOO- +煮沸的脾脏蛋白.

　　图2Western Blot 法检测脾脏蛋白对ONOO-诱导GDH硝基化修饰的逆转作用（略）

　　3讨论
 
　　目前已有逾百种硝基化蛋白被鉴定［1］，但针对特定蛋白的功能调控尚知之甚少. 本研究首次报道，硝化剂ONOO-对GDH这一典型的别构酶［7］具有功能调控作用.

　　本研究发现，ONOO-的作用与浓度密切相关： 低浓度（4~12 μmol/L ）ONOO-不影响GDH催化活性，但使GTP的别构抑制作用显著降低，从而可间接地使GDH的总催化活性升高；中等浓度（36~108 μmol/L）ONOO-，一方面可显著抑制GDH催化活性，另一方面使GTP的别构抑制作用降低，二者综合的结果可使GDH总的催化活性或者升高，或者降低，或者不变；高浓度（324 μmol/L）ONOO-，可使GDH完全灭活，别构调节作用也完全丧失. GDH这些功能改变与酪氨酸硝基化呈正相关．由此可以推测GDH硝基化可能是机体的一种感受机制，当内环境发生改变导致ONOO-过量产生时，GDH通过硝基化的方式来调控其总催化活性（升高，降低，或者不变）；当内环境改变超出了机体的反馈能力后，GDH的硝基化则成为一种损伤机制（彻底灭活）.

　　硝基化一般导致蛋白功能丧失［2］. 但本研究发现，GDH硝基化可使其催化功能间接地升高，这与微粒体谷胱甘肽?S?转移酶1（MGST1）的硝基化具有类似之处［8］. 两者不同之处在于，GDH在活性调控上比MGST1更具有灵活性：前者总的催化活性可升可降亦可不变，后者的催化活性只是升高；前者的修饰可被逆转，后者修饰的逆转性尚未确立；此外，MGST1被ONOO-修饰，还可形成蛋白二聚体和三聚体［8］，而本研究未发现GDH存在这些修饰.

　　值得指出，高浓度（324 μmol/L）ONOO-诱发的硝基化不能被“去硝基化酶”逆转，提示ONOO-可能还导致GDH发生了其他修饰，例如羰基化等，引起酶构象发生改变，从而不能被“去硝基化酶”识别．作者初步研究结果支持这一推测，我们发现，108~324 μmol/L ONOO-处理GDH样品，可分别检测到（0.89 ± 0.18）和（1.69 ± 0.16） nmol/mg羰基基团，而0~36 μmol/L ONOO-处理的样品检测不到，提示高浓度ONOO-不仅导致硝基化，同时引起了羰基化修饰.

　　综上所述，本研究表明ONOO-可通过酪氨酸硝基化调控GDH的催化功能.

【】
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　　［2］ 池泉，黄开勋. 蛋白质酪氨酸硝化的研究 ［J］. 化学进展，2006，18（7/8）：1019-1025.

　　［3］ Choudhury R, Punekar NS. Competitive inhibition of glutamate dehydrogenase reaction. ［J］. FEBS Lett, 2007,581(14):2733-2736.

　　［4］ Lai HH, Yen GC. Inhibitory effect of isoflavones on peroxynitrite?mediated low?density lipoprotein oxidation［J］. Biosci Biotechnol Biochem, 2002,60(1):22-28.

　　［5］ Kanavouras K, Mastorodemos V, Borompokas N, et al. Properties and molecular evolution of human GLUD2 (neural and testicular tissue?specific) glutamate dehydrogenase［J］. J Neurosci Res, 2007,85(5):1101-1109.

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