云母颗粒对大鼠乙酸性结肠炎炎症与修复反应的影响
作者：钦丹萍 杨莹莹 邵国民 任永葆 韩建新
【摘要】 ［目的］研究云母颗粒（简称云母）对大鼠乙酸性结肠炎的作用及可能机制；［方法］造模后用云母混悬液灌肠，每天一次，观察造模后第3天及第14天时结肠黏膜损伤程度和光镜下表现，测定血清及结肠组织中的EGF、TNFa含量；［结果］云母第3天和第14天时对乙酸性结肠炎大鼠结肠黏膜损伤大体观及组织学均有改善作用，同时使大鼠血清及结肠组织的修复因子EGF含量相对增加，致炎因子TNFa含量相对降低。［结论］云母对大鼠乙酸性结肠炎的治疗作用可能与其相对提高修复因子EGF含量，降低致炎因子TNFa含量有关。
【关键词】 结肠炎；云母颗粒乙酸性；表皮生长因子；肿瘤坏死因子
Abstract: ［Objective］ To study Mica granule’s treatment on rats’ ethanoic acid colitis and the possible mechanism. ［Method］ After modelling, apply Mica suspending liquid for enema once a day, observe demonstration under microscope and enteric mucosa injury at 3th day and 14th day, measure EGF and TNFa in serum and colon tissue. ［Result］ The Mica had improvements on colon mucosa injury and tissue of rats with colitis generally, meanwhile it could comparatively add EGF?the repair factor in colon and serum of rats, also decrease inflammatory factor TNFa. ［Conclusion］ Mica’s treating rats’ ethanoic acid colitis may be related with its comparatively raising repair factor EGF and reducing TNFa.
Key words:colitis; ethanoic acid of Mica Granules; epidermis growth factor; tumor necrosis factor
溃疡性结肠炎（ulerative colitis，简称 UC）是一种原因不明的慢性非特异性炎症性结肠病，以腹痛、腹泻、黏液脓血便和里急后重为主要表现，具有病程漫长、病情反复、缠绵难愈、容易复发等特点，被世界卫生组织列为难治病之一。中药云母为鳞片状天然矿石，既往实验研究［1］表明云母能有效缓解大鼠脾虚泄泻，保护肠黏膜。本实验采用UC模型之一的大鼠乙酸性结肠炎模型，观察云母对大鼠乙酸性结肠炎的作用，并通过表皮生长因子（简称EGF）和肿瘤坏死因子a（简称TNFa）的测定来揭示云母治疗UC的可能机制。
1 实验材料
动物模型：SD大鼠108只，SPF级，体重200±20g，雄性，购自中科院上海实验动物中心，标准饲料饲养于浙江中医药大学实验动物中心。药物及制备：云母由浙产绢云母组成，粒子直径40%以上达6250目，由江苏江阴中药厂制剂；必奇（蒙脱石散剂）：海南先声药业有限公司生产，产品批号：040912；灌肠时均加适量生理盐水（NS）进行稀释。仪器与试剂：病理切片机（LEICARM2025 德国Leica公司），FJ?2003?50G型Y计数仪（中科院上海原子能研究所日环仪器一厂），TNFa和EGF试剂盒（北京北方生物技术研究所）。
2 实验方法
2.1 造模与实验方法 SD大鼠随机分为云母高、中、低剂量组，必奇组，模型对照组，空白对照组六组，每组动物均为18只。Pedorak［2］方法结合预实验情况改进。大鼠适应性饲养1周，禁食不禁水20h，经肛门插入导管至距肛门口约8cm处，用浓度为9%的乙酸2ml灌肠，20s后立即用生理盐水5ml冲洗，造模结束。于造模后3h各治疗组用不同浓度云母混悬液灌肠，必奇组用必奇混悬液灌肠，模型组和空白对照组以等容量NS灌肠，均每d1次；给药剂量云母高、中、低剂量组用药剂量分别为0.72g/100g、0.36g/100g、0.18g/100g；必奇组为0.60g/100g；每只大鼠（体重以200g计）在使用规定剂量的前提下用药容量在7ml。造模后第3天每组处死大鼠8只，第14天处死剩余大鼠，分别取血和结肠组织。
2.2 观察指标
2.2.1 结肠黏膜损伤指数 大鼠处死后，立即取距肛门2～6cm处长约4cm的新鲜结肠标本，沿肠系膜缘剖开肠腔，用生理盐水将肠内容物冲洗干净后，用滤纸吸干，平铺于滤纸上，肉眼观察结肠黏膜损伤程度。结肠黏膜损伤程度以损伤指数［3］计：0：无损伤；1：轻度充血水肿，表面光滑，无糜烂或溃疡；2：充血水肿，黏膜粗糙，呈颗粒状，有糜烂和肠粘连；3：高度水肿，黏膜表面有坏死及溃疡形成，溃疡最大纵径＜1cm，肠壁增厚或表面有坏死及炎症；4：重度充血水肿，黏膜表面有坏死及溃疡形成，溃疡最大纵径≥1cm，或全肠壁坏死。
2.2.2 病检查 在新鲜结肠标本上沿肠系膜缘及其对侧纵取长约1.5厘米、宽0.3厘米肠壁组织两块。HE染色，光镜下判断黏膜损伤程度。结肠黏膜损伤病理学分度［3］计：0：正常；1：充血水肿，少量炎性细胞浸润；2：浅表糜烂，黏膜及黏膜下层广泛充血、水肿、炎性细胞浸润；3：隐窝脓肿，黏膜层坏死及溃疡形成加2病变；4：黏膜层及黏膜下层坏死，溃疡深达黏膜下层或肌层，加2、3病变。取病理学标本后剩余结肠组织即刻放入冻存管置于液氮中保存。
2.2.3 血及结肠黏膜中EGF和TNFa含量测定，按照说明书操作进行，数据由FJ?2003?50G型Y计数仪电脑分析得出。
2.3 统计学方法 用SPSS12.0软件包对各组数据进行统计分析，多组间均数比较用方差分析，均数间两两比较用q检验，等级资料用秩和检验，均以P<0.05为差异显著的检验标准。
3 结果
3.1 结肠黏膜损伤程度的变化 实验第3天时正常组黏膜光滑，无糜烂和溃疡，光镜下见黏膜层结构完整连续，腺体排列紧密；模型组、云母中、低剂量组及必奇组黏膜表面充血水肿、表面糜烂、坏死，溃疡形成（>1cm），光镜下可见大量急性炎症细胞浸润，溃疡形成，其中模型组溃疡深达肠壁肌层，无腺体残留，其余溃疡均未超过黏膜层，有部分腺体残留；云母高剂量组大鼠结肠黏膜充血水肿，表面糜烂，溃疡形成（<1cm），光镜下可见黏膜层坏死，溃疡形成局限于黏膜层。对结肠黏膜损伤指数分析显示：云母高剂量组与模型组相比有统计学差别（P<0.05）；云母高剂量组与低剂量组相比有统计学差别（P<0.05）。对结肠粘膜损伤病理学分度分析显示：云母高剂量组、必奇组与模型组相比均有统计学差别（P<0.05）。
实验第14天时正常组粘膜未见异常；模型组黏膜充血、水肿，表面糜烂，溃疡形成（<1cm），光镜下可见大量急性和慢性炎症细胞浸润，黏膜坏死缺损，溃疡形成达黏膜肌层；必奇组黏膜疤痕挛缩明显，皱襞平坦，光镜下可见较多急慢性炎症细胞浸润，黏膜充血水肿，轻度坏死形成；云母组黏膜充血、水肿，表面糜烂，光镜下可见少量炎症细胞浸润，黏膜充血水肿糜烂，糜烂程度随着剂量增加而减轻。对结肠黏膜损伤指数分析显示：云母高剂量组显著低于模型组（P<0.01），与空白对照组相比已无明显差别（P>0.05）；云母中剂量组及必奇组亦低于模型组（P<0.05）。对结肠黏膜损伤病分度分析显示：云母高剂量及中剂量组显著低于模型组（P<0.01）；云母低剂量组及必奇组亦低于模型组（P<0.05）；云母高剂量组与云母低剂量组相比存在着统计学差别（P<0.05）。
因此，从第3、第14天云母各组对结肠黏膜损伤指数、黏膜损伤病理学分度的作用上看，这种作用存在着剂量依赖，有量效关系。
3.2 对血清及结肠组织EGF含量的影响 实验第3天时血清和结肠组织EGF含量六组间无统计学意义（P>0.05）；第14天血清EGF含量，云母高、中剂量组，必奇组高于模型组（P<0.05）；第14天匀浆EGF含量云母高、中剂量组高于模型组（P<0.01，P<0.05），同时高剂量组高于低剂量组（P<0.05）。
3.3 对血清及结肠组织TNFa含量的影响 实验第3天时血清含量高剂量组高于模型组（P<0.05），匀浆各组与模型组之间无差别（P>0.05）。第14天血清含量云母高、中剂量组，必奇组低于模型组（P<0.01）；匀浆TNFa含量云母各组，必奇组低于模型组（P<0.01，P<0.05）。
3.4 血清、匀浆EGF和TNFa从第3天和第14天的演变 从第3到第14天，各组（除空白组）血清、结肠组织EGF大致呈下降趋势，其中仅血清模型组的下降有统计学意义（P<0.05）。各组（除空白组）血清TNFa显示上升（P<0.01）；匀浆TNFa呈下降趋势，各组的下降均无统计学意义（P>0.05），见表1。
表1 云母对大鼠EGF、TNFa的影响（略）
与空白对照组比较,★★P<0.01；与空白对照组比较；★P<0.05；与模型组比较，▲▲P<0.01；与模型组比较有差异，▲P<0.05；与云母高剂量组比较﹡P<0.05
4 讨论
近年来UC在我国的发病率有增加趋势，并且目前本病的西医药物效果仍不十分理想。UC症状散见于中医“痢疾”、“泄泻”、“肠癖”等疾病，中药云母药用最早记载于《神农本草经》、《本草纲目》，谓其性味“甘、平、无毒”，“能除邪气、补中、安五脏、金创出血”有“止血敛疮”的作用，《药性论》亦指出云母“主下利肠僻”。大鼠乙酸性结肠炎是UC动物模型之一，本实验研究表明，云母在第3和第14天对大鼠乙酸性结肠炎均有治疗作用，作用存在着剂量依赖性。
EGF是一种单链多肽活性物质，具有促进上皮细胞生长繁殖，加速受伤上皮细胞的修复的作用［4］，是UC病程中的修复性因子；TNFa属于细胞源性炎性介质，具有诱发炎症反应等多种生物学效应，已被公认对UC的发生有介导作用，是UC病程中的致炎性因子。文献报道UC时TNFa含量显著升高，并与疾病严重程度呈正相关［5］，本实验结果与文献报道相符。
本实验研究发现，EGF在疾病过程中显示出下降趋势，云母和必奇可以减少EGF的下降幅度，在第3天时，各组血清及匀浆EGF均未表现出明显差异，但至第14天时，云母高、中剂量组血清及匀浆中的EGF含量均已显著高于模型组，与必奇组无差别，可见其对EGF含量有相对增加作用，与必奇组作用相当。TNFa从第3到第14d在血清中呈上升趋势，在结肠组织中呈下降趋势，云母能使其在血清中的上升幅度减小，在组织中的下降幅度增大，在第3d时，各组TNFa含量并无任何有意义的改变，而在第14d时，云母各组血清及匀浆（除血清低剂量组）含量均低于模型组，与必奇组无差别，可见其可降低TNFa含量，作用与必奇相当。
由此我们推测，云母对UC治疗作用与其相对提高血清和结肠组织中修复性因子EGF含量，降低致炎性因子TNFa含量有关。
【文献】
［1］ 钦丹萍，周亨德.胃肠德对大鼠脾虚泄泻的作用机制研究［J］.医药学报，2003，18（12）：751.
［2］ Pedork RN, EmPey LR, Mac Aurther C et al.MisoProstal Provides a colonic mucosal Protective effect during acetic acid?induced colitis in rats［J］. Gastroerology, 1990,98（3）:615.
［3］ 邓长生，夏冰，陈德基，等.SOD对大鼠乙酸性结肠炎黏膜的保护作用［J］.中国病理生理学杂志，1994，10（1）：23?25.
［4］ 林军，邓长生，陈德基，等.表皮生长因子和谷氨酞胺的胃肠黏膜保护作用［J］.国外医学内分册，1994，21（5）：210?212.
［5］ Tian L,Huang YX,Tian M，et al.Downregulation of electroacuPuncture at ST36 on TNF?alPha in rats with ulcerative colitis［J］.World J Gastroenterol, 2003,9（5）:1028?1033.
