爪蟾卵母细胞固醇调控通路的建立及姜黄素的作用

                作者：沃立科 范春雷 沃兴德 

【摘要】  　　［目的］在爪蟾卵母细胞中建立人类SCAP/SREBP固醇调控系统，利用此系统研究姜黄素对SCAP/SREBP调控通路的作用。［方法］构建带有绿色荧光报告蛋白基因的PLXRN?4SRE?fpa质粒，将构建质粒和其他几种质粒分别提取混和成实验组质粒和对照组质粒，通过微注射的方法分别共注射到Ⅴ、Ⅵ爪蟾卵母细胞核内，与不同浓度的姜黄素共孵育3天，使用荧光定量PCR检测荧光表达量。［结果］相同浓度的姜黄素对注射含有固醇调节元件质粒的卵母细胞荧光表达量要明显高于不含相应元件的质粒。［结论］构建的质粒pLXRN?4SRE?fPA能在爪蟾卵母细胞中有效地应答SCAP、SREBP调控因子；通过影响SCAP/SREBP调控通路调节SRE?1下游基因的表达可能是姜黄素调脂作用的机理之一；利用核内共注射的方法在爪蟾卵母细胞中建立的SCAP/SREBP调控系统可作为SCAP配体类药物快速筛选和作用机制研究的细胞模型。

【关键词】  爪蟾卵母细胞 姜黄素 SCAP/SREBP固醇调控通路

　　Abstract: ［Aim］ The expressed system of sterol regulation by SCAP/SREBP Pathway was established in the oocyte of the Xenopus laevis and was applied to investigate the effect of cucurmin on the SREBP pathway.［Methods］ The plasmid of PLXRN?4SRE?fpa was restructed and injected into the nucleus of Xenopus Oocytes in phase V or VI. The oocyte was incubated with different concentrations of the curcumin. After three days the fluorescence intensity on the membrane of the Oocytes was measured by Fluoroanalyzer.［Results］ The fluoresecence intensity on the membrane of the oocyte increased with increasing of the concentration of the curcumin. The trail group which have all regulation elements of SCAP/SREBP pathway can express more fluorscence protein than the control group. ［Conclusion］ The experiment provides that the curcumin can upgrade the expression of low density lipoprotein receptor by SCAP/SREBP regulation pathway. The model can be applied for quick screening of the scap ligand drugs and inverstigating the mechanism of the drugs.

　　Key words: Oocyte of Xenopus Laevis; curcumin; SCAP/SREBP regulation pathway
   
　　活血化瘀中药姜黄中提取的姜黄素具备降血脂抗动脉粥样硬化作用，特别是能够降低血清胆固醇和甘油三酯,［1?2］其作用可能是通过对脂酶和低密度脂蛋白受体的调节。［3?5］我们考虑姜黄素可能是通过SCAP/SREBP固醇调控系统，以SCAP配位体形式出现的高效低毒新型降脂药。为了证明这一作用我们构建了SCAP/SREBP固醇调控系统质粒，经核注射方法注入两栖类爪蟾卵母细胞中进行高效表达，经与不同浓度姜黄素孵育，通过检测绿色荧光的量来分析姜黄素的作用。

　　1  材料与方法

　　1?1  材料  成年雌性非洲爪蟾，购自院上海细胞所，由本室饲养，可供常年使用。大肠杆菌感受态细胞DH5α购自上海生物工程有限公司；PCMV?SREBP?1a460,PCMV?SCAP购自ATCC公司；pQBI25?fPA购自Qbiogene公司；pBSK?SRE委托上海生物工程有限公司合成；PLXRN由BD Bioscience Clontech提供。姜黄素 (纯度≥97%，HPLC)，购自安徽甙尔塔天然有机化合物信息中心。

　　1?2  方法

　　1?2?1  基因合成：我们应用PBSK质粒，根据调节SREBP表达的调控元件SRE的碱基序列（5′?ATCACCCCAC?3′）设计了含有SRE调控元件的基因，并在调节元件下游设计了多克隆酶切位点，可方便插入目的基因和进行质粒重构等基因操作。

　　1?2?2  构建质粒pBSK?4SRE?GFP:用限制性内切酶NheI/MluI分别双酶切pQI25?fpa质粒，pBSK?4SRE质粒经连接转化，酶切鉴定，测序鉴定。

　　1?2?3  构建质粒pLXRN?4SRE? GFP:用限制性内切酶SalI/BlnI分别双酶切重组质粒pBSK?4SRE?fPA和pLXRN，经连接转化，经酶切和测序鉴定。根据pLXRN?4SRE? GFP质粒的理论碱基序列，分别在插入的目的基因外侧和内部（GFP）设计了两对PCR引物。外侧:P1，5’?TTTTGCTTTCGGTTTGGA?3’； P2，5’?CAGGAGCAAGGTGAGATG?3’。内部:P3，5’?GATGACGGCAACTACAA?3’；P4，5’?CGAAAGGGCAGATTG?3’。以pLXRN?4SRE? GFP质粒为模板，分别用P1/P2和P3/P4引物对进行扩增。PCR条件均为94℃ 50 s, 48℃ 50 s, 72℃ 50 s, 循环30次；取样进行琼脂糖凝胶电泳。

　　1?2?4  爪蟾卵母细胞显微核注射：冰麻成年雌性爪蟾，单侧剖腹取出爪蟾卵母细胞，使用Ⅱ型胶原酶消化过夜，选取高质量Ⅴ、Ⅵ期爪蟾卵母细胞600枚，用碱裂解法分别提取pCMV?SREBP1a?460、pCMV?SCAP、pLXRN、pLXRN?4SRE?GFP等质粒，使用核酸检测仪进行定量分析，将所有质粒用无菌水稀释到1ug/ul浓度，等体积混和pCMV?SREBP?1a460、pCMV?SCAP、pLXRN?4SRE?fpa作为实验组，等体积混和pLXRN?4SRE?GFP、pCMV?SCAP、pLXRN作为对照组。实验组和对照组分别对200枚蛙卵进行核内注射。另取200枚卵不作核注射，作为试剂空白组。

　　1?2?5  姜黄素对SRAP/SREBP调控通路的影响：将每组200枚卵随即分成4小组，每组50枚卵，分别用含0uM、20uM、30uM、40uM浓度姜黄素的有钙OR2培养液孵育72h，每12h换液1次。72h后，将各组卵母细胞随机取10枚卵母细胞，各加入100ul无菌水， 500W超声15次，间隔10s，每次15s。装到两个PCR管中。应用荧光定量PCR进行检测,增益设定56,20循环。

　　2  结果

　　2?1  构建质粒与鉴定  设计合成的含有SRE调控元件的pBSK?4SRE质粒经上海生物工程技术公司测序符合设计要求,调节元件的序列与人类基因库中序列一致(图1)

　　图1  pBSK?4SRE测序结果与设计的序列相符重构质粒pLXRN?4SRE?GFP经2次双酶切，经 PCR扩增后在琼脂糖电泳中可见1900bp和320bp两个产物（见图2）送上海生工进行测序。基因测序与酶切鉴定结果一致，证明pLXRN?4SRE?fPA质粒构建成功(图3)(略)
   
　　图2  pLXRN?4SRE?GFP质粒PCR鉴定：pLXRN?4SRE?GFP经2次双酶切后，用PCR进行扩增，可见两个扩增产物，分别为1900bp和320bp。(略)   
　　
　　图3  质粒pLXRN?4SRE?GFP的测序结果及图谱(略)

　　2?2  姜黄素对爪蟾卵母细胞存活率的影响

　　表1  不同浓度姜黄素对爪蟾卵母细胞活性的影响 (略)

　　卵母细胞用含不同浓度姜黄素的培养液培养后生存率平均在90%以上,因此上述浓度和作用时间对爪蟾卵母细胞培养不影响细胞存活率。

　　2?3  姜黄素对爪蟾卵母细胞固醇调控通路的影响将碱裂解法提取的质粒pCMV?SREBP?1a460、pCMV?SCAP、pLXRN?4SRE?fpa均稀释到1ng/nl，同比混合后核注射至爪蟾卵母细胞作为实验组，pLXRN?4SRE?GFP、pCMV?SCAP、pLXRN稀释到1ng/nl，同比混合后核注射至爪蟾卵母细胞作为对照组，未注射质粒的卵母细胞作为试剂空白组,使用不同浓度姜黄素培养液孵育3d后测定荧光表达量。

　　表2  不同浓度姜黄素对基因注射组荧光强度的影响(略)

　　实验组与对照组比较,*P<0?05
   
　　实验结果发现：姜黄素本身不会产生荧光，而当姜黄素与卵母细胞孵育后则产生荧光，其荧光强度与对照组一致，然而实验组的荧光强度要明显高于对照组和试剂空白组。

　　3  讨论

　　最近国外正在研制的新型调脂药物，试图从SREBP通路中寻找SCAP配位体药物，这类药物可通过与SRE?1结合由于LDL增加引起的高胆固醇血症，其降胆固醇效果优于他汀类。我们在前期工作中发现姜黄素具有明显降胆固醇作用［3,5］，并且可能通过LDL受体途径起作用，我们设想姜黄素也可以通过SREBP调节途径，具有SCAP配位体的效应，起到调节胆固醇的作用。固醇调节元件1（Sterol Regulatory Element?1，SRE?1）是脂代谢受体LDLR基因上游的调控元件。SREBP的裂解片段bHZH穿过核孔与核内的SRE?1结合诱导SRE?1下游的LDLR表达，控制LDLR基因的转录，达到调节细胞内胆固醇水平的效果。SREBP是控制胆固醇和脂肪酸代谢的活性因子，可控制脂代谢相关基因的表达，如脂蛋白脂肪酶、apo AII等。SREBP作为SRE?1配位体调节LDLR表达的同时也受到SCAP的调控，SREBP与SRE?1的结合是在细胞核内，而SREBP的前体却是在内质网装配合成的，SCAP是SREBP由内质网向高尔基体转运的伴随蛋白，因此SCAP直接影响到SREBP修饰。产生的SREBP终产物转移至细胞核内与SRE?1结合，调控下游LDLR的表达。这就构成了一个完整的SCAP/SREBP代谢调控通路。为了建立SCAP/SREBP调控通路的模型以及中药对SCAP/SREBP调控通路的作用，我们在基因质粒的下游构建了绿色荧光报告蛋白（GFP），GFP有很多优点，可以进行实时分析，使用的样本量较小，能高通量定量分析等。为了能使基因质粒能在细胞中高效表达和便于测定，我们采用爪蟾卵母细胞，因为爪蟾卵母细胞具有外源基因表达的所有元件。实验发现由于实验组具备SREBP调控通路中的所有元件，而对照组缺乏其中的关键元件SREBP，在实验条件和药物浓度相同的情况下，实验组表达的荧光量明显高于对照组。由于对照组随着姜黄素浓度增加也会出现荧光，我们考虑姜黄素除了通过SCAP/SREBP途径外可能还有其他的途径。经对姜黄素与卵母细胞孵育后荧光强度测定，其结果与对照组的结果相一致，那就说明，姜黄素作为脂溶性物质，易通过细胞膜进入细胞内，可能与细胞内的某一蛋白质结合，使其具有荧光，因为当单独对姜黄素溶液测定的时候，姜黄素本身并不具有荧光。综上所述，我们得出以下几个结论：(1)应用爪蟾卵母细胞建立脂代谢相关的实验模型能够有效地应答相关调控因子和药物。(2)在爪蟾卵母细胞中建立SCAP/SREBP调控通路模型，可作为作用于SCAP/SREBP通路的中药筛选和机理研究的实验平台。(3)姜黄素可以增加SCAP对SREBP前体从内质网向高尔基体的护送能力，同时也能增强SREBP的表达水平，从而增加SRE?1配体的生成量，上调LDLR的表达，从而起到降血脂抗动脉粥样硬化作用。(4)由于试剂空白组也产生荧光，考虑姜黄素可能影响了卵母细胞内另一些途径，有待进一步研究。

【】
  　　［1］ 沃兴德,洪行球,赵革平,唐丽华. 姜黄素对低密度脂蛋白和脂蛋白(a)代谢的影响［J］.动脉粥样硬化杂志, 1999，7(4):339?341.

　　［2］ 沃兴德,洪行球,高承贤. 姜黄素提取物对食饵性高脂血症动物和高脂血症患者降脂作用的研究概况［J］.浙江中医学院学报,1998,22(6):7.

　　［3］ 高波，范春雷. 姜黄素对巨噬细胞LDL受体表达的影响［J］.浙江中医学院学报,2005,29（1）：432?435.

　　［4］ Chunlei Fan, Xingde Wo, Ying Qian, Jin Yin, Liping Gao. Effect of curcumin on the expression of LDL receptor in mouse macrophages［J］.J Ethnopharmacol, 2006,105(1?2):251?254.

　［5］ 窦晓兵, 范春雷, 洪行球, 钱颖, 沃兴德. 姜黄素对人淋巴细胞低密度脂蛋白受体表达影响的研究［J］.中国药学杂志, 2005,40(13):980?983.

　　［6］ 沃兴德.姜黄素及其衍生物抑制肿瘤的实验研究［J］.浙江中医学院学报, 2005,29(2):53.