甲状腺乳头状癌nm23?H1、CD31表达与肿瘤转移关系的研究

             作者：方海飞 沈美萍 徐银峰 

【摘要】  　　［目的］研究甲状腺乳头状癌组织中nm23?H1和CD31的表达水平与甲状腺癌转移的关系。［方法］应用EnVisionTM免疫组织化学法检测55例甲状腺乳头状癌和10例癌周组织nm23?H1蛋白和CD31蛋白的表达；并计数CD31标记的肿瘤组织微血管密度。［结果］甲状腺乳头状癌组织中nm23?H1阳性表达率为65.46%，均高于癌周组织，差异有统计学意义（P<0?01）；微血管密度（MVD）与nm23?H1的表达之间存在负相关关系。［结论］nm23?H1抑制甲状腺癌肿瘤微血管形成，在抑制肿瘤转移中起重要的作用。

【关键词】  甲状腺乳头状癌 nm23?H1 CD31 肿瘤转移

　　Abstract：［Objective］ To study the expressions of nm23?H1,CD 31 in papillary thyroid cancer tissues and the correlation with the lymph node metastasis. ［Methods］ nm23?H1,CD31 were detected by EnVisionTM immunohistochemistry method in 55 tomour tissues and 10 normal tissues; the expression of CD31 was used for the mark of the vascular endothelial cell, the tumor microvascular density(MVD).［Results］ The positive expression rate of nm23?H1 in papillary thyroid cancer was 65?46%, The expression levels of nm23?H1 in papillary thyroid cancer tissue were higher than in normal throid tissue(P<0?01). There was negative relationship between MVD and nm23?H1. ［Conclusions］ nm23?H1 promotes microvascular emerged in papillary thyroid cancer tissues and plays an important role in the lymph nodes metastasis.

　　Key words: Papillary thyroid cancinoma;nm23?H1;CD 31;Tumor metastasis
   
　　全世界甲状腺癌发病率约占全身恶性肿瘤的1%～2%，我国年发病率为0?5～40人/10万人，近几年来，我国甲状腺癌的发病率呈逐年上升趋势，尤其以女性明显增加，对人类健康危害极大。其中甲状腺癌分化性癌占80-90%，甲状腺乳头状癌的转移方式多为淋巴结转移，年轻人的乳头状癌患者确诊时，淋巴结转移率高达90%［1］。目前，对甲状腺癌的转移机制尚不清楚。本文研究nm23?H1（nonmetastatic gene23?H1）和CD31在甲状腺乳头状癌的发生、转移关系，为指导甲状腺癌临床诊断及判断预后提供。

　　1  材料与方法

　　1?1  临床资料  收集2003年1月至2006年1月中甲状腺乳头状癌组织标本55例，年龄15~71岁（平均43?56±14?54），男11例，女44例。患者临床资料完整,术前均未接受化疗和放疗,均为经典根治术，有淋巴转移或远处转移的35例，无转移的20例，经病理检查证实均为原发甲状腺乳头状癌。TNM分期［1］：Ⅰ期16例，Ⅱ期19例，Ⅲ期18例，Ⅳ期2例。对照组为10例正常甲状腺组织，取自甲状腺癌周围组织（简称癌周组织），经病理检查确认均为正常组织。取手术切除的组织标本，经10%福尔马林固定,常规脱水透明、浸蜡、包埋，连续切片，切片厚4μm，用于EnVisionTM免疫组织化学法。

　　1?2  主要试剂和免疫组织化学方法  一抗为即用型兔抗人nm23?H1多克隆抗体和鼠抗人CD31蛋白单克隆抗体（JC70A，M082301，Dako公司）；EnVisionTM试剂盒（Dako公司，工作液），购自上海基因公司。采用EnVisionTM两步法。石蜡切片常规脱蜡至水，微波修复抗原，3%H2O2溶液室温孵育20min，以消化内源性过氧化物酶，10%正常羊血清封闭30min，分别加一抗nm23?H1，湿盒中孵育，4oC过夜，滴加二抗，EnVisionTM试剂室温孵育1h。各步骤间均以0?01mol/L PBS缓冲溶液冲洗5min连续3次。DAB? H2O2显色，显微镜下控制时间，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片，Olympus BX?41显微镜观察、照相。用PBS缓冲溶液代替一抗，作为阴性对照，以甲状腺乳头状癌癌周组织作对照组。

　　1?3  结果判断  nm23?H1免疫组化染色的阳性判定，细胞浆和部分细胞核着棕色颗粒者为阳性，不着色者为阴性。结果以显微镜下每张切片取5个高倍视野（200×），数每个高倍视野下的阳性细胞所占比例，并依据每高倍视野中阳性细胞率0%为阴性（-），10%～25%为弱阳性（+），26%～50%为中阳性（+ +），>50%为强阳性（+ + +），其中弱阳性和中阳性为低表达，强阳性为高表达［2］。CD31结果判断及MVD：CD31的阳性表达产物主要分布于血管内皮细胞的胞浆内，呈棕黄色或棕褐色染色。每张切片在脉管高密度区，随机选取5个视野（200×，0?075mm2），分别计数后，取平均值，作为该例肿瘤的MVD。

　　1?4  统计学处理  计量资料两组间比较用t检验，计数资料两组间比较用χ2检验。采用SPSS 13?0统计软件进行Spearmant等级相关分析检验。

　　2  结果

　　2?1  nm23?H1在甲状腺癌中的表达  nm23?H1阳性表达产物主要分布于细胞质内，部分也分布在细胞核，呈棕黄色颗粒染色（见图1）。本研究的甲状腺癌中nm23?H1阳性表达率65?46%（36/55），癌周组织中nm23?H1阳性表达率为10?00%（1例），两者间的差异有统计学意义（P<0?01)。甲状腺乳头状癌nm23?H1阳性表达在临床分期中有明显差异，在Ⅰ+Ⅱ期中nm23?H1阳性高表达率为48?57%(17/35),在Ⅲ+Ⅳ期阳性高表达率为20?0%(4/20),二者比较差异有统计学意义（P<0?05）；甲状腺乳头状癌nm23?H1阳性表达在有无淋巴转移中也有明显差异,无淋巴转移强阳性表达率为75?5%(15/20)，有淋巴转移强阳性表达率为17?14%(6/35), 二者比较差异有统计学意义（P<0?01）；而在年龄、肿瘤大小和临床分期方面无明显差异（见表1）。

　　2?3  CD31在甲状腺癌组织和癌周组织中的表达  CD31阳性表达主要位于甲状腺癌周围间质的血管内皮细胞（见图2）。癌组织的MVD明显高于癌旁组织。MVD表达在有无转移和临床分期中有明显差异，而在年龄和肿瘤大小方面无明显差异（见表1）。
   
　　图1  甲状腺乳头状癌nm23?H1表达，胞浆、胞核内可见棕黄色的阳性颗粒；EnVisionTM法×400 (略)  

　　图2  CD31标记的甲状腺乳头状癌组织内微血管（↑），可见微血管较多。(略)

　　“☆”所指是癌组织，“→”所指是微血管， EnVisionTM法×400

　　表1  甲状腺乳头状癌和癌周组织中nm23?H1和MVD与临床病理指标的比较(略)

　　*P<0?05，**P<0?01

　　2?4  甲状腺癌组织中MVD与nm23?H1表达的关系  nm23?H1阳性表达的甲状腺乳头状癌组织中MVD值明显高于阴性者,二者比较差异有统计学意义。提示nm23?H1表达与MVD之间存在着负相关(r=-0?620, P<0?01)。

　　3  讨论

　　nm23?H1基因是1988年由美国国立癌症研究所Steeg等［3］从K1735鼠黑色素瘤细胞株中用消减杂交法分离出来的一种与恶性肿瘤转移有关的基因，他们发现nm23基因在高转移癌细胞中低表达，而在低转移或不转移的癌细胞中高表达，具有抑制肿瘤转移作用。nm23基因定位于染色体17q21?3［4］。nm23?H1作为肿瘤转移抑制基因，因其表达产物核苷二磷酸激酶（NDPK），参与细胞的信号传递、微管组装，从而可特异性的抑制肿瘤转移［5］。随着肿瘤进展和淋巴、血转移的发生，肿瘤细胞抑癌蛋白的表达量减少，逐渐失去肿瘤细胞对生长、转移的抑制。本研究结果显示，nm23?H1在甲状腺乳头状癌中的表达显著高于癌周组织，甲状腺乳头状癌中无淋巴转移者nm23?H1阳性表达率高于有淋巴转移者，临床分期中的Ⅰ+Ⅱ者nm23?H1阳性表达率和阳性的高表达均高于Ⅲ+Ⅳ者。表明nm23?H1表达阴性者，肿瘤转移性强，预后差；nm23?H1表达强阳性者肿瘤转移性弱，预后好。 血管的生成可以直接影响肿瘤细胞的淋巴结转移［6］。CD31作为血管内皮细胞的标记物，直接反映了甲状腺乳头状癌微血管的生成情况。本研究发现，甲状腺乳头状癌组织中CD31的表达明显高于癌旁正常的甲状腺组织，通过MVD计数发现二者比较差异有统计学意义（P<0?05）。通过研究发现在有淋巴结转移的肿瘤组织微血管数量显著高于无淋巴结转移组，表明甲状腺乳头状癌组织内血管生成与肿瘤转移密切相关，微血管数量越多，转移的机会越大。统计学结果显示，甲状腺乳头状癌组织中MVD与nm23?H1表达之间存在负相关性。说明nm23?H1表达越高，MVD在一定程度上也越少，这提示nm23?H1在一定程度上有抑制甲状腺癌肿瘤微血管形成，在抑制肿瘤转移中起重要的作用。从本研究结果显示来看，甲状腺乳头状癌nm23?H1和CD31的表达与甲状腺乳头状癌的转移及临床分期相关，而癌症的临床分期与转移又直接影响患者的预后。这表明nm23?H1表达逐渐减弱和MVD逐渐增高，是甲状腺乳头状癌病情进展和肿瘤转移的重要信号；这认为nm23?H1表达越低，MVD越增加，肿瘤转移性越强，预后越差。这提示甲状腺乳头状癌中nm23?H1 和CD31表达水平可作为判断临床疗效和预后指标。

【】
  　　［1］ gregory W.Randolph saunders, surgery of the thyroid & parathyroid glands. elsecier science(U.S.A). 2003,194.

　　［2］ Kojc N, Zidar N, Vodopivec B, et al. Expression of CD34, alpha?smooth muscle actin, and transforming growth factor beta1 in squamous intraepithelial lesions and squamous cell carcinoma of the larynx and hypopharynx. Hum Pathol.2005 Jan;36(1):16?21.

　　［3］ Steeg PS, et al.Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential.J. Natl Cancer Inst,1988,80:200?204.

　　［4］ Edith H, et al.Molecules in focus NM23?NDP kinase.J,The International Journal of Biochemistry & Cell Biology.J., 30（1998）:1291?1295.

　　［5］ Valentijn L,Koster J,Versteeg R, Read?through transcript from NM23?H1 into the neighboring NM23?H2 gene encodes a novel protein, NM23–LV.Genomics,2006,87(4):483?489.

　　［6］ 傅玉峰，丁炯，VEGF的表达与胃癌生物学特性的实验研究［J］.南京医科大学学报（版）.2006,9,26(9):749?752.