桃核承气汤对蓄血证大鼠血管MMP?2,TIMP?2基因表达的影响

【摘要】  ［目的］观察桃核承气汤对蓄血证大鼠血管基质金属蛋白酶?2(Matrix Metalloproteinase?2，MMP?2)及金属蛋白酶?2组织抑制剂( Tissue Inhibitor of Metalloproteinase?2，TIMP?2)基因表达的影响，探讨此方的作用机制。［方法］半定量RT－PCR检测各组大鼠颈总动脉匀浆中MMP?2、TIMP?2基因的表达，进行分析。［结果］与模型组相比,药物组减少了MMP?2基因的表达，增加了TIMP?2的表达(P<0.01)。［结论］桃核承气汤能改变蓄血证大鼠动脉壁MMP?2、TIMP?2基因的表达，这可能是其主要作用机制之一。

【关键词】  桃核承气汤；蓄血证；基质金属蛋白酶?2；金属蛋白酶?2组织抑制剂

　　Abstract： ［Objective］To investigate the effects of Taohechengqitang(THCQT) on the gene expression of Matrix Metalloproteinase?2(MMP?2) and Tissue Inhibitor of Metalloproteinase?2(TIMP?2)in artery vessel of Xuxuezheng rats.［Methods］Half quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT?PCR) was used to detect MMP?2 and TIMP?2 gene expression in artery vessel.They were analyzed.［Results］While compared with model group，MMP?2 gene expression levels in the THCQT group were lower,and TIMP?2 was higher (P<0.01).［Conclusion］THCQT can change the gene expression of MMP?2 and TIMP?2 in artery vessels of Xuxuezheng rats,which may account for the effects.

　　Key words: Taohechengqitang;Xuxuezheng;MMP?2;TIMP?2
   
　　桃核承气汤是《伤寒论》中蓄血证的主方之一，具有活血祛瘀、泻热攻下的功效，在临床上，已经证实可以有效地治疗各科疾病；而既往实验研究也已表明其有改善微循环［1］，抗肿瘤［2］等作用。但蓄血证及桃核承气汤与MMP?2、TIMP?2是否具有相关性，缺乏报道。本文探讨桃核承气汤对蓄血证大鼠血管MMP?2、TIMP?2基因表达的影响。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  健康雄性SD大鼠30只，体重300～350g（由浙江中医药大学实验动物中心提供）。造模材料：大肠杆菌内毒素（E.Cole O55:B5），美国Sigma公司产品，用生理盐水配成20μg/ml的溶液。药液制备：桃仁∶大黄∶桂枝∶芒硝∶甘草=2∶2∶1∶1∶1（中药饮片由浙江中医药大学门诊部提供），适量水煎，头煎20min，二煎30min，分别滤取药液，合并两次药液，在60℃恒温条件下浓缩成每ml含生药1g的药液备用。主要试剂：Trizol reagent,美国Invitrogen 公司产品；反转录试剂盒(Reverse Transcription System)，美国Promega 公司；Taq DNA 聚合酶，Takara公司；β?actin 引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。主要仪器：台式高速冷冻离心机，德国Heraeus 公司；PCR仪，TECHNE；紫外分析仪，ZF－1型，上海嘉鹏科技公司；电泳仪，DYY－8B型稳压稳流电泳仪；核酸蛋白仪，Amersham Biosciences。

　　1.2  方法  将30只大鼠按随机数字表法分成空白对照组(control)、模型组(model)、药物组(THCQT)3组，每组10只。造模方法［11］：模型组，间隔24h，两次尾静脉注入大肠杆菌内毒素（剂量分别为50μg/kg）；药物组，于第1次注入内毒素前2h左右，胃管内注入药物（10ml/kg），12h后再给药1次，在第2次注入内毒素前2h左右再给药1次；对照组，两次尾静脉注入生理盐水，剂量方法同上。
   
　　RNA的提取及逆转录：第2次注入内毒素（或生理盐水）后2h，大鼠以3%戊巴比妥钠腹腔麻醉(4.5ｍｇ/100ｇ)，取出各组大鼠颈总动脉0.5g，分别以Trizol试剂提取总RNA。提取后以紫外光分光光度计测定其纯度并定量，在1%的甲醛变性凝胶上电泳验证RNA完整性。逆转录以AMV逆转录酶提供的体系为标准，在PCR管中配制逆转录反应液，轻轻混匀，室温放置10min后移入恒温槽中，42℃保温1h进行逆转录反应。反应结束后在冰水中冷却2min。所得到的反应液用于PCR反应。
   
　　PCR检测MMP?2、TIMP?2的基因表达量：根据genebank上提供的MMP?2,TIMP?2基因的序列设计引物，引物序列见表1。以Actine基因作为内参，进行PCR反应。取上述的逆转录产物2μL作为PCR反应的模板，反应体系为50μL，于0.2 mL PCR薄壁管中依次加入反转产物2μL,dNTP8μL，PCR10×Reaction Buffer 5μL，Taq DNA Polymerase 0.5μL，上下引物2μL，MgCl2 2μL，DEPC水30.5μL。扩增条件：94℃预变性5min后，94℃变性30s、48℃退火40s、72℃延伸40s，反应30个循环，最后一轮72℃延伸5min，同时设置PCR扩增仪的热盖温度为105℃。扩增产物取5μL在1%琼脂糖(含EB 0.5 ng/mL)上电泳，另取3u1 Marker作为DNA片段大小的对照。紫外灯下观察结果并照相，吸光度扫描仪扫描后PCR条带用软件进行定量分析，每一个基因的表达量用Actine内参进行标准化，结果为基因表达量对Actine内参的比值。
   
　　统计学方法：数据以均数±标准差(x±s)表示，统计学处理应用SPSS11.5软件，采用方差分析和q检验，P<0.05为差异有显著性。

　　2  结果
   
　　所提的动脉壁组织总RNA 经核酸蛋白仪纯度鉴定为良好，电泳鉴定证实RNA 完整性较好。定量分析显示：与对照组相比，模型组与药物组MMP?2基因的表达均增加( 均为P<0.01)；与模型组相比，药物组能减少MMP?2基因的表达(P<0.01)；与对照组相比，模型组与药物组TIMP?2基因的表达显著减少( 均为P<0.01)；与模型组相比，药物组增加了TIMP?2 基因的表达(P<0.01)，见图1，表1、2。

　　表1  RT?PCR引物序列（略）

　　表2  各组动物动脉壁中MMP?2与TIMP?2相对基因表达量比较（略）

　　d P<0.01 vs control；f P<0.01 vs model

　　图1  MMP?2与TIMP?2的基因表达电泳（略）
   
　　M：100bp标准分子量Marker；1：MMP对照组，2：MMP模型组，3：MMP用药组；1’：TIMP对照组，2’：TIMP模型组，3’：TIMP用药组

　　3  讨论
   
　　MMPs是一类Zn2+依赖性内肽酶，在降解各种细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)中起着重要的作用，也因此对组织器官发育、创伤愈合、血管新生、骨的生成、巨噬细胞游走等生理过程都有着重要的影响；在许多病理状态下，MMPs表达的增加与活性增高进而导致ECM的变化可以引起组织的损伤，许多疾病和其有着密切的关系，如肿瘤细胞周围的ECM降解是肿瘤细胞发生浸润、转移的必要步骤。MMP?2又名明胶酶A（Gelatinase A），属于MMPs家族中的明胶酶类，主要作用是降解IV型胶原和明胶。实验证实肝癌［3］、食管癌［4］、宫颈癌［5］、肾癌［6］等各种肿瘤疾病中均可以发现MMP?2的显著高表达。TIMP?2是MMP?2的天然抑制物，是抑制MMPs活性的多功能因子家族中的成员，MMP?2和TIMP?2两者基因表达水平的变化，对诸多疾病的形成、与预后都有着相当大的影响。除了肿瘤，还有诸如肝纤维化［7］、心血管病［8］等严重危害人民健康的疾病的进展中，两者也都起着相当大的甚至关键的作用。MMPs抑制剂类药物的研究开发是当前对肿瘤等疾病的防治的研究热点之一。中医药研究已经证实相当多的中药可以对MMP?2，TIMP?2进行有效干涉。
   
　　“蓄血证”出自《伤寒论》，广泛用于诸多种存在热瘀之象的内伤疾病的病机分析。有学者认为，心血管病、肿瘤等疾病的一些发展阶段与中医的蓄血证类似［9］。如有效地糖尿病肾病［10］、急性脑出血［11］等各科疾病；而实验研究也表明其有抗肿瘤［12］等作用。
   
　　本实验结果显示蓄血证造模可使大鼠的MMP?2基因的表达明显增加，TIMP?2基因的表达明显减少，提示中医的蓄血证涉及到MMPs的改变，而后者引起的组织的损伤可能是蓄血证病理变化的重要因素；联系前述的MMPs与肿瘤的关系，有关肿瘤等疾病的发展过程中可以出现类似蓄血证病变的论断在一定程度上得以证实，由此可能可以运用蓄血证理论对肿瘤等疑难重症进行及早而有效的干预。桃核承气汤可以引起增加的MMP?2基因的表达趋于减少，降低的TIMP?2的表达趋于提高，提示桃核承气汤对各种疾病的有效治疗中，引起MMP?2，TIMP?2的表达量的改变进而阻止机体的进一步的病理变化可能是其较重要的作用机制之一，对桃核承气汤的进一步深入研究，有可能提取开发出较好的MMPs抑制剂类药物应用于肿瘤等疾病的治疗。
   
　　有研究证明，桃核承气汤有明显的抑制ECM增殖的效用，与我们的实验结果似乎存在差异，这是否与两者的药物剂量、疾病实验模型等的不同及中药的双向调节性有关，值得进一步研究。

【】
  　　［1］ 何赛萍.桃核承气汤对热瘀大鼠模型血液流变学和凝血指标的影响［J］.浙江中医学院学报,2003,27(6):56?58.

　　［2］ 许洪霞,王雅贤,许艳霞,等.桃核承气汤对荷瘤小鼠影响的实验研究［J］.中医药信息,2006,23(1):52?53.

　　［3］ 朱彩荣,曾祥凤,陈亚进,等.MMP?2、TIMP?2和VEGF?C在肝细胞性肝癌中的表达及其与淋巴结转移关系的研究［J］.病理生理杂志,2005,21(7):1336?1339.

　　［4］ 李杰茹.MMP?2与TIMP?2的比值与食管癌侵袭转移的关系［J］.肿瘤防治杂志,2005,12(14):1083?1086.

　　［5］ 罗仪,陈双郧,张昌军.Survivin、MMP?2、TIMP?2在宫颈癌中的表达及其与侵袭、转移的关系［J］.西安大学学报(医学版),2005,26(2):176?180.

　　［6］ 唐伟清.MMP2、TIMP2在人肾透明细胞癌中的表达及意义［J］.中华泌尿外科杂志,2005,26(3):l84?187.

　　［7］ 吴运瑾,翟为溶,庄丽,等.大鼠肝纤维化模型中基质金属蛋白酶一2及其抑制物的表达［J］.上海医科大学学报,1999,26(4):261?264.

　　［8］ 张军.大鼠心肌梗死后心肌NF?κB、MMP?2和TIMP?2表达变化及其意义［J］.心脏杂志，2006,18(1):54?59.

　　［9］ 赵泽明.去甲斑蝥素对荷瘤裸鼠胆囊癌移植瘤nm23、基质金属蛋白酶?2和基质金属蛋白酶组织抑制因子?2的影响［J］.中华实验外科杂志,2005,22(3):307?308

　　［10］ 许广大.丹参对急性重症胰腺炎早期肺损伤MMP?2、MMP?9表达的影响［J］.中华中医药学刊,2007,25(2):262?263

　　［11］ 何赛萍.论蓄血证及动物模型的制作［J］.浙江中医学院学报,2002,26(6):13?14.

　　［12］ 王廷春.加味桃核承气汤治疗糖尿病肾病138例临床观察［J］.国医,2000,15(2):10?12.