糖尿病大鼠海马神经元电压门控钠离子通道的研究
【摘要】 ［目的］研究糖尿病大鼠海马神经元电压门控钠离子通道的变化，探讨糖尿病神经系统的退化机制。［方法］用全细胞膜片钳技术记录糖尿病大鼠海马神经元Na+电流的变化。［结果］糖尿病大鼠海马神经元电压门控钠离子通道的Na+电流I?V曲线明显上移。［结论］糖尿病大鼠海马神经元钠离子通道Na+电流水平下降。
【关键词】 糖尿病；海马神经元；钠离子通道；电压门控；实验研究
Abstract： ［Objective］ To study the change of voltage gated sodium channel of diabetic rats’ hippocampal neurons and explore the degenerating mechanism of diabetes’s nerve system.［Methods］ Sodium currents of diabetic rats’ hippocampal neurons were registered by using the whole?cell patch?clamp technique.［Results］ The I?V curve of sodium currents of voltage gated sodium channel of diabetic rats’ hippocampal neurons was shifted to the much higher level.［Conclusion］ Sodium currents of voltage gated sodium channel of diabetic rats’ hippocampal neurons decreased.
Key words: diabetes；hippocampal neuron；sodium channel；electric?pressure controled door；experimental study
离子通道是镶嵌于膜脂质双分子层中的糖蛋白，是膜电位形成的基础，它们形成的动作电位与梯度电位是神经元之间信息交流的基础，可分为门控性和非门控性［1］。糖尿病病人晚期常有痴呆的表现［2?4］，主要表现为学习、记忆能力下降，神经系统存在一定的功能障碍，而学习记忆的关键部位在海马。本项目研究糖尿病大鼠海马神经元钠离子通道的变化，进一步探讨糖尿病脑病的机制，为临床上糖尿病及糖尿病性脑病的防治提供一定的理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物和试剂 健康雄性SD大鼠20只，清洁级，体重200～250g，由浙江大学医学院动物实验中心提供。链脲佐菌素、蛋白酶、河豚毒素（TTX）、HEPES等均为Sigma公司产品。
1.2 动物模型制备 将适应性饲养1w后的大鼠随机分为正常对照组和糖尿病模型组，每组各10只。禁食12h后，糖尿病模型组大鼠腹腔注射PH4.4枸橼酸钠缓冲液配成的1.25% STZ，50mg/kg；正常对照组大鼠腹腔注射相同剂量的PH4.4枸橼酸钠缓冲液。3天后选择尿糖（+++～++++）、血糖≥16.7mmol／L者为造模成功。
1.3 大鼠海马神经元的急性分离 腹腔注射STZ 8w后，大鼠断头取脑，在孵育液中分离出海马并切成400μm厚的脑片，加入蛋白酶在30℃下消化30min后用孵育液洗脑片3次，放入盛有氧饱和标准细胞外液的离心管内，用Pasteur吸管轻轻吹打，静止约2min，取上部的细胞悬液加入含标准细胞外液的灌注槽内，约15min后细胞贴壁于涂布多赖氨酸的圆形盖玻片上，即进行全细胞膜片钳记录。
1.4 全细胞膜片钳记录 玻璃微电极拉制后尖端直径为1～2μm，充灌电极液后电阻2～8mΩ，记录在室温（20～24℃）下进行.采用Axoclamp 2A膜片钳放大器记录膜电流，膜电流信号经放大器输入DigiData 1200B A/D，D/A转换器进行数模转换后存入机硬盘，采样频率10KHz，钳制电位、信号采集与储存和结果分析等均借助计算机用Pclamp6.0.4和Origin5.0软件完成，数据处理采用SPSS 10.0统计软件，数据以均数±标准差（x±s）表示，组间显著性采用t检验。
2 结果
2.1 一般情况观察 正常组大鼠警觉好动，毛色光泽，每天每只大鼠平均自由饮水约70ml左右；成模后模型组大鼠反应明显迟钝，精神萎靡，喜欢趴在鼠笼上，毛色渐渐失去光泽，每天每只大鼠平均自由饮水约200ml左右，尿量明显增加。两组大鼠空腹血糖变化见表1。
表1 两组大鼠空腹血糖比较（略）
与正常对照组比较，△△P<0.01
2.2 糖尿病大鼠海马神经元Na+电流I-V曲线的变化 在钳制电压置于-100mV，给于-100mV到0mV的阶梯去极化脉冲刺激（步幅为10mV，波宽为20mS，频率为0.5Hz），记录得到的电流可被1μmol.L-1的河豚毒素阻断,证实为Na+电流.取电流幅度的平均值为纵坐标,对相应的膜电位作I-V曲线,结果显示,糖尿病模型组海马神经元Na+电流I-V曲线显著上移，如图1。
图1 糖尿病模型组海马神经元Na+电流I-V曲线（略）
3 讨论
近年来，糖尿病性脑病引起了国内外的广泛关注，糖尿病病人晚期常有痴呆的表现，主要表现为学习、记忆能力下降，病人的生活质量明显下降。大量的研究表明，海马与近期记忆有关，当两侧海马较大范围损伤时可引起近期记忆的高度丧失，失去了学习新事物及新技巧的能力，其程度常取决于海马损伤的范围。
本研究结果显示：用全细胞膜片钳技术记录糖尿病大鼠海马神经元Na+电流的变化，测得的糖尿病大鼠海马神经元电压门控钠离子通道的Na+电流I-V曲线明显上移，即钠电流减少。电压门控性钠离子通道由1个大的α亚单位和2-3个附属的β亚单位组成的异聚体［4］，其中α亚单位是主要的功能单位，可单独发挥生作用。电压门控钠通道开启所形成的内向电流是产生动作电位上升相的必要条件，该通道的变化会影响神经元动作电位的产生和传导，从而影响中枢神经系统神经元之间及各脑区间进行信息交流和调控，进而影响到整个神经系统的功能。本研究为我们考虑用作用于离子通道的药物来糖尿病脑病提供一定的实验依据，具体有待于进一步的研究。
【】
［1］ Celesia G.Disorders of membrane channels or chennelopathies［J］.Clinical Neurophysiology，2001，112：2?18.
［2］ 盛树力.糖尿病脑病与老年性痴呆［J］.中华内分泌代谢杂志，2001，17(1):58?59.
［3］ 翼瑞俊，贾建平.糖尿病认知障碍的相关因素分析［J］.脑与神经疾病杂志，2003，11（2）：69?72.
［4］ Ott A，Stolk RP，van Hanskamp F，et al.Diabetes mellitus and the risk of dementia：the Rotterdam Study［J］.Neurology，1999，53（9）：1937?194.
