三叶青提取物对人结肠癌细胞系RKO细胞凋亡的影响
【摘要】 观察三叶青提取物对人结肠癌细胞系RKO细胞凋亡的作用，初步探讨其可能的机制。［方法］采用体外细胞培养技术，用MTT法观察三叶青提取物RKO细胞的影响；琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡；RT?PCR检测Bid，Bax，Bcl?2和Bcl?XL的表达改变。［结果］三叶青提取物能显著地抑制人结肠癌细胞系RKO细胞的生长，并且具有浓度依赖性，且细胞有明显的凋亡特征性改变，并能下调Bcl?XL、上调Bid来诱导凋亡。［结论］三叶青提取物具有对人结肠癌细胞系RKO细胞抗增殖和诱导凋亡的作用，且呈剂量依赖性。
【关键词】 三叶青提取物 RKO细胞 凋亡
Abstract: ［Objective］ To observe clover extract’s effect on human colon cancer PKO cellular apoptosis, primarily explore its possible mechanism. ［Method］ Take cell culture in vitro and MTT technology to observe clover extract’s influence on PKO cell, test apoptosis with agarose gel electrophoresis, test the changes of Bid, Bax, Bcl?2 and Bcl?XL with PT?PCR. ［Result］ Clover extract can markedly inhibit PKO growth, with dependence of concentration and obvious apoptosis change, also can down?regulate Bcl?XL, up?regulate Bid to cause apoptosis. ［Conclusion］ Clover extract has anti?hyperplasia and induces apoptosis to human colon cancer cellular PKO, in dependence of concentration.
Key words: clover extract; PKO cell; apoptosis
以往研究发现三叶青活性成分对体外培养的人结肠癌细胞系RKO具有显著的细胞毒作用，并表现为凋亡特征。为使三叶青在结肠癌临床方面提供理论依据，而进一步做此研究。
1 材料和方法
1.1 细胞系和药物 大肠癌细胞系RKO由上海细胞研究所提供。三叶青提取物由丁刚强博士提供。
1.2 实验方法 取对数生长期RKO细胞，用含10%灭活小牛血清的RPIM1640培养基，于37℃、5%CO2条件下培养。用含10％小牛血清的新鲜RPIM1640培养基稀释和三叶青活性物母液（5mg/ml），使成所需浓度（5～15μg/ml），作用细胞48hrs。（1）体外细胞生长抑制试验。RKO细胞悬液（2×105/ml）分别以三个平行复孔接种于96孔板，每孔100μl。37℃培养24hrs使细胞贴壁，用含不同浓度三叶青活性物的新鲜培养基配成终体积200ul，37℃孵育68h后，每孔加50μl MTT（2mg/ml），继续培养4hrs，平板离心1000rpm×10min，弃去上清，加120μl DMSO溶解MTT结晶，平板振荡10min，570nm下Elisa读值（Wallac）。（2）DNA梯带检测。收集经5、10、15μg/ml三叶青提取物和加等量的溶剂作用48h的RKO细胞，用含50mM Tris?HCL(PH7.5)，20mM EDTA和1％NP?40裂解缓冲液裂解，然后加1％SDS和Rnase（5μg/ml）到上清中，56℃孵育2hrs，再加蛋白酶K（2.5μg/ml）37℃孵育2hrs。用醋酸铵（3.3M）和酒精（95%）溶解沉淀，加入上样缓冲液。DNA梯带经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色观察。（3）RT?PCR检测。RKO细胞2×105/ml浓度以3个平行复孔接种于24孔板，每孔100ul（含2×104细胞），培养24h使贴壁。不同浓度三叶青活性物作用48hrs后，依次进行下列试实验：①细胞总mRNA的提取（氯仿一步法）；②紫外分光光度计测定mRNA的含量；③反转录：dNTP(each 10mmol/L)2μl、5×buffer 4μl、DTT(100mmol/L)1μl、RNAsin(40U/μL)1μl、Oligo dT(100μmol/L)1μl、总RNA2μg加水至18μl后65℃水浴5min，并快速插入到冰水中，加入RNAsin(40U/μl)1μl和M?MLV反转录酶（200U/μl）1μl后再37℃水浴60min，94℃水浴5min（灭活返转录酶），-20℃保存；④PCR扩增：dNTP(each 0.5mmol/l)2μl、10×buffer4μl、Mgcl2(25mmol/l)4μl、上游引物(4μmol/l)1μl（Bax，ACCAAGAAGCTGAGCGAGTGT；Bcl?xl，GGAGCTGGTGGTTGACTTTCT；Bcl?2，ACTTGTGGCCCAGATAGGCACCCAG；Bid，GAC CCG GTG CCT CAG GA；β?actin，AGGCCAACCGCGAGAAGATGACC）、下游引物(4μmol/l)1μl（Bax，ACAAACATGGTCACG GTCTGC；Bcl?xl，CCGGAAGAGTTCATTCACTAC；Bcl?2，CAGC TTC GCCGAGATGTCCAGCCAG；Bid，ATGGTCACGGTCTGCCA；β?actin，GAAGTCCAGGGCGACG TAGCAC）、反转录产物4μl和Taq?DNA聚合酶（U/μl）0.4μl并加水至40μl，用石蜡油25μl封盖；扩增条件为：95℃，3min；94℃40s，59℃1min，72℃2min，共30个循环；72℃，5min；最后4℃保存，并电泳后比较。⑤图像处理：取电泳凝胶底片，用KS400型图像分析系统进行光密度扫描，以目的基因光密度值与对应内参基因光密度值的比值作为该样品中目的基因的相对转录量。最后以目的基因的相对转录量为参数进行半定量统计分析。
1.3 统计学方法 计量资料数据统计用均数±标准差(x±s)；多组间均数之间比较用方差分析(F检验)，均采用spss统计软件包统计分析。
2 结果
2.1 抑制RKO细胞增殖 三叶青提取物体外抑制RKO细胞增殖，其细胞毒性与药物浓度和作用时间呈正比。如图1A所示，5μg/ml及其以上浓度作用68hrs引起RKO细胞增殖抑制，10μg/ml时细胞数量明显减少，导致半数细胞死亡的药物浓度(IC50)大约是12.47μg/ml。图1B所示一定药物浓度时，药物的抑制作用与作用时间呈正比。
2.2 DNA梯带出现 根据三叶青提取物对RKO细胞毒性的IC50，我们以5、10、15ug/ml作为检测浓度。如图2所示，药物处理组细胞基因组DNA断裂，经琼脂糖凝胶电泳出现180bp?200bp倍数的梯带。这些现象提示，三叶青提取物诱导体外培养的RKO细胞发生凋亡。
图1 细胞毒性与药物浓度和作用时间呈正比（略）
2.3 RT?PCR检测Bid，Bax，Bcl?2和Bcl?XL的表达 用RT?PCR方法检测不同浓度三叶青提取物对Bcl?2家族的表达影响，结果发现Bcl?XL的表达有显著性的下降，Bid的表达有显著的上调，Bax和Bcl?2没有明显变化（见图3）。
图2 药物处理组细胞基因组DNA断裂（略）
图3 RT?PCR检测Bid，Bax，Bcl?2和Bcl?XL的表达（略）
3 讨论
三叶青的化学成分目前尚未十分明了，丁钢强等［1?2］对三叶青的乙酸乙酯、正丁醇和水3种提取法进行了比较，结果显示以乙酸乙酯提取法效果最好，主要是有4个化合物，分别为β?谷甾醇、山奈酚、槲皮素和山奈酚?3?O?新橙皮糖苷。其中槲皮素是植物界分布最广，具有多种生物活性的黄酮类化合物，广泛存在于蔬菜和水果中，同时它也是多种中草药的成分，具有降血压、降血脂、抗炎、抗过敏、抗病毒等多种生物学活性，对人类肿瘤、衰老、感染、心血管疾病的和预防具有重要意义；而且最近的研究表明［4］，槲皮素一方面可以诱导多种肿瘤细胞凋亡，另一方面又可以阻止一些非肿瘤细胞凋亡的发生。
恶性肿瘤细胞的主要特征之一为其失控的自主性增殖，是细胞增生和死亡调控异常导致其平衡失调的综合性结果。细胞凋亡的调控是级联式基因表达的结果。目前认为，细胞内部的基因直接调控凋亡的发生和，细胞外部因素通过信号转导通路影响这些基因的表达，从而间接调控凋亡。Bax是bcl?2家族的一个主要成员，它们过度表达可诱发细胞凋亡；Bcl?xL作用在Apaf?1的上游，它能通过其BH4区将胞浆中的Apaf?1结合到线粒体外膜，从而阻断Apaf?1对caspase?9的激活作用，从而导致细胞凋亡。近年研究证明，肿瘤细胞确实存在细胞凋亡过程异常，在很多肿瘤细胞有肿瘤抑制基因p53的缺失和突变，因此凋亡过程的减弱显而易见。在肿瘤细胞还发现有bcl?2基因过度表达。细胞凋亡的特征性表现是DNA梯带出现，这是DNA在核小体连接部位被剪切的结果，与细胞内特定蛋白酶系统激活有关。
本研究结果表明，三叶青提取物5～15μg/ml浓度作用48hrs后，RKO细胞基因组DNA电泳出现剂量依赖性梯带增强，说明该药物引起RKO细胞凋亡。为探讨细胞凋亡的机制，我们检测了线粒体凋亡通路上的主要凋亡相关基因及表达产物Bcl?2家族成员。结果如图3所示，Bcl?2家族成员中的抑凋亡因子Bcl?XL的信使RNA和蛋白表达均剂量依赖性增加，而促凋亡因子Bid在基因和蛋白水平都表现为下调。Bcl?XL是线粒体膜蛋白，表达下降会引起膜通透性增加，导致细胞色素C释放。因此，三叶青提取物引起的RKO细胞凋亡是通过下调Bcl?XL、上调Bid，最终可能导致导致线粒体释放细胞色素C，级联激活Caspase家族成员所致。且三叶青提取物（5?15μg/ml）诱导人结肠癌细胞系RKO细胞凋亡呈剂量依赖性。
【】
［1］ 丁钢强，郑军献，魏克民，等.三叶青提取物对肝癌细胞HepG2及原代大鼠肝细胞的体外毒作用研究［J］.浙江预防医学，2005，17(9)：1?5.
［2］ 李瑛琦，陆文超，于治国.三叶青的化学成分研究［J］.中草药，2003，34(11)：982?831
［3］ Lee LT，Huang YT，Hwang JJ，et al.Blockade of the ep idermal growth factor receptor tyrosine kinase activity by quercetin and luteoin leads to growth inhibition and apop tosis of pancreatic tumor cells［J］.Anticancer Res，2002，22 (3)：1615?1627.
