家族性急性髓系白血病差异表达基因的筛选

             作者：王少元， 张轶文， 王程毅  '

【摘要】  目的建立简便可靠的非同位素杂交筛选方法，筛选家族性急性髓系白血病cDNA消减文库中的差异表达基因。方法用地高辛（DIG）标记消减文库cDNA作为探针，通过差异筛选技术进行差异表达片段的筛选，杂交阳性结果经RT?PCR再度验证。结果DIG标记探针浓度为250～500 pg/μL，效率为48%～96%，并且杂交信号清晰，重现性好。应用DIG标记探针改良的差异筛选技术所得到的阳性结果经RT?PCR验证符合率达到86%。结论采用DIG标记探针具有高度的灵敏度和良好的特异性，可避免放射性污染，简化实验操作，可作为替代同位素32P?dCTP标记探针的方法。

【关键词】  系谱,白血病； 急性病； 基因表达； 地高辛； DNA，互补； 基因文库

 
    经抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术构建的cDNA消减文库，包含着丰富的差异表达信息，是研究疾病发生分子机制的重要信息来源。但是，如何从浩瀚的信息库中筛选出有价值的差异表达基因，要求有一种简便、实用、快速、可靠的筛选技术，该技术不仅要有高效的筛选效率，而且应具有高度的灵敏度和特异性，同时操作不能繁琐，可在普通实验室开展。因此，笔者建立地高辛（digoxin，DIG）标记探针替代同位素标记探针的改良差异筛选（differentially screening）技术，对家族性急性髓系白血病cDNA消减文库的差异表达基因进行筛选，取得良好效果。

    1材料与方法

    1.1主要仪器与试剂总RNA提取采用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；Super SMART cDNA Synthesis Kit、PCR?Select cDNA Subtraction Kit、PCR?Select Differential Screening Kit（美国Clontech公司）；QIAquick PCR Purification Kit和QIAGEN OneStep RT?PCR Kit（德国Qiagen公司）；DIG DNA Labeling and Detection Kit、DIG Wash and Block Buffer Set和DIG Easy Hyb（德国Roche公司）；Hybond N+膜（瑞典Amersham公司）；其余试剂为国产或进口分析纯试剂。PCR扩增仪为PE 2400/9600/9700（美国生物应用系统公司）。

    1.2cDNA消减文库构建实验方和驱动方分别取自福建省1个白血病高发家族中的患者和正常人[1]，参照Super SMART cDNA Synthesis Kit及PCR?Select cDNA Subtraction Kit操作说明书同时进行正向和反向消减杂交。消减产物连接质粒后克隆至大肠杆菌，构建cDNA消减文库。

    1.3DIG标记探针的制备及标记效率检测取正反双向消减（FS和RS）和未消减（FU和RU）的第2轮PCR产物作为待标记的探针，经限制酶RsaⅠ去除人工接头后，紫外分光光度仪测定其光密度（D）值，

    各自的浓度。分别取经过酶切并纯化后的产物1 μg，按照DIG DNA Labeling and Detection Kit说明书配制反应体系，37 ℃孵育20 h。然后将标记好的探针与试剂盒提供的DIG标记探针标准曲线进行比对，估测样本浓度范围，计算DIG标记探针的含量。标记好的探针贮存于-20 ℃备用。

    1.4差异片段的筛选

    1.4.1cDNA点膜固定随机挑取白色克隆接种于96孔板，过夜摇菌后，每孔取菌液1 μL按序分别点于4张相同的滤膜上，置于含有氯化钠、胰蛋白胨、酵母提取液及氨苄青霉素（LB/Amp）的培养板上过夜；将滤膜经碱变性、中和，120 ℃固定1 h，4 ℃保存备用。

    1.4.2预杂交将处理好的4张膜分别放入4个杂交袋中，加入预热至42 ℃的杂交液，清除气泡，封闭杂交袋，预杂交30 min，并轻柔振荡。

    1.4.3杂交弃去预杂交液，按照3.5 mL/100 cm2重新加入预热的DIG Easy Hy杂交液，再加入变性好的探针（每毫升杂交液至少含有25 ng DIG标记的探针），分别与4张膜于42 ℃杂交过夜。

    1.4.4洗膜、显色将滤膜置入事先预热至68 ℃的含有0.5×SSC和0.1% SDS的高严谨洗液中洗膜2次后，再经封闭、DIG?AP抗体孵育、再洗膜等步骤后，加入NBT/BCIP底物于暗室中显色。显色结果按PCR?Select Differential Screening Kit中关于差异片段的筛选标准进行。

    1.5测序及同源性分析将差异筛选鉴定的含有差异表达基因片段的阳性克隆送交上海中科开瑞生物芯片科技股份有限公司测序；测序结果与NCBI的GenBank+EMBL+DDBJ+PDB的非冗余数据库(non?redundant database，NR)进行同源性比较。

    1.6半定量逆转录聚合酶链反应（RT?PCR）鉴定斑点杂交筛选根据测序结果设计基因特异性引物，内参照选择人类管家基因3?磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde3?phosphate dehydrogenase,G3PDH)基因，反应结束在到达平台期之前，操作按照QIAGEN OneStep RT?PCR Kit说明书进行。

    2结果

    2.1消减效率以G3PDH为内参照基因进行SSH消减效率分析，发现消减组中的G3PDH到33个循环时出现比较明显的条带，而未消减组在18个循环时就有明显的条带出现，两者相差15个循环，而相差10个循环即说明消减成功。Tester中非特异表达的基因被高效扣除，反映cDNA消减文库被成功构建（图1）。

    1~8：正向消减组；1’ ~8’：反向消减组；1~4和1’~4’：以G3PDH 5'和3'作为引物扩增的消减组第2轮PCR产物；5~8和5’ ~8’：以G3PDH 5'和3'作为引物扩增的未消减组第2轮PCR产物；1&5和1’&5’：18个循环；2&6和2’&6’：23个循环；3&7和3’&7’：28个循环；4&8和4’&8’：33个循环.

    图1消减效率

    Fig 1Reduction of G3PDH abundance by PCR?Select subtraction

    2.2DIG标记效率及探针浓度采用DIG标记的模板DNA量为1 000 ng，标记时间为20 h，Dot Blot结果（图2），第一排8个点及第二排前3个点为标准液的印迹，最后一个是试剂盒提供的阳性对照，其余4个从左至右分别是FS、FU、RS、RU 4组探针的杂交信号。标准液第一管浓度为1 ng/μL，以后各管按照1∶2依次稀释，共11管，比较它们与标准液的颜色深度。4组探针的颜色梯度位于第2点与第3点之间，即250～500 pg/μL，经过转换计算，经DIG标记后得到的DIG?DNA总量是375～750 ng，与Kit中780 ng/20 h相比，产率是48%～96%。而每次只需要87.5 ng的探针就足够与100 cm2滤膜进行杂交，且探针保存在杂交液中可以重复使用若干次，表明DIG标记的高产率及高灵敏性。

    A1~A8、B1~B3为标准液的印迹；B4~B7分别是FS、FU、RS、RU 4组探针的杂交信号；B8为试剂盒提供的阳性对照.

    图2DIG标记标准液估测样本浓度

    Fig 2Determination of the yield of DIG?labeled cDNA

    2.3筛选差异表达基因随机挑取白色克隆126个，接种于LB/Amp平板上，制备相同的4张尼龙膜，与DIG?11?dUTP标记的正反消减组和未消减组各2组共4组探针，同时进行斑点杂交，按照差异筛选杂交结果判断标准，获得有差异表达的阳性克隆75个。斑点杂交的部分结果见图3。

    2.4表达序列标签（expressed sequence tags，EST）成功测序的序列经去除载体和引物序列并相互比对，共得到有效序列28个。同源性比对分析，有17个片段与已知同源基因高度相似，11个片段在人类基因库中找不到相似的序列或相似性很低，表明它们是新EST片段，可能代表着新的基因。目前这11个片段均已登录GenBank，获得登录号[2]。17条已知基因分别涉及基因转录、翻译、DNA损伤修复、细胞周期蛋白依赖激酶、细胞周期蛋白、蛋白酶抑制因子等基因，均与细胞的增殖和分化有关。

    2.5RT?PCR鉴定随机选取14条经差异筛选杂交技术判断为差异表达基因的序列片段，将其进行人类基因组DNA扫描、定位，选取中间存在间隔序列的区域作为设计引物的模板，设计好的引物再进行BLAST搜索是否与所要扩增的目的基因同源。用RT?PCR方法验证这些序列在两样本中是否存在差异表达，结果有12条片段在两样本中存在着差

    a1：正向消减cDNA探针；a2：反向消减cDNA探针；b1：未消减实验方cDNA探针；b2：未消减驱动方cDNA探针. a组：消减cDNA探针分别来源于正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库；b组：未消减cDNA探针分别来源于实验方RNA和驱动方RNA. 4组探针分别与构建的实验方cDNA消减文库进行斑点杂交. C1：G3PDH cDNA片段（阳性杂交对照）；D1：阴性杂交对照（cDNA 1R）；E1：阴性杂交对照（cDNA 2R）.

    3讨论

    比较筛选cDNA文库，确定疾病相

    关的易感基因是基因研究的目的之一。要实现这一目的，必须建立一种有效的基因筛选技术以实现对候选基因的筛选。如果筛选众多的已知表达基因，DNA芯片技术无疑是较好选择。而对未知表达基因则大多通过差异筛选或基因表达系列分析来实现[3]。

    差异筛选技术是针对SSH技术产生大量目的片段而设计的分离目的基因的一项技术，一次可对96个克隆同时进行筛选，具有高效的筛选效率；而且由于采用4组探针同时与目的基因片段进行杂交，通过对比同一个目的基因片段和4个杂交信号强弱、有无的差异，能够较准确判断差异表达基因。本研究也证明了差异筛选技术是高效和可靠的。

    但是，因为采用同位素32P?dCTP标记探针有一定放射性，使得差异筛选技术的应用范围受到一定限制，尤其是在那些不具备同位素操作的实验室无法开展此项工作。为了解决这一问题，需要一种非同位素的示踪物质来标记探针，并且试验结果仍应达到差异筛选技术的相当水平。本实验选择了DIG?dUTP标记探针来替代同位素32P?dCTP，根据实验结果及笔者的经验表明，用DIG标记探针有4个明显的优势：（1）避免在同位素操作过程中，由放射性防护带来的不便；（2）显色时间短，并且显色步骤可以在肉眼直视下进行，使显色程度得到很好的控制；（3）显色图片质量好，背景较低，不会出现放射性探针曝光胶片中的点状背景；（4）杂交信号颜色深浅对比性强，方便判断目的基因在不同样本中的相对含量。

    报道，差异筛选所得阳性结果经采用Virtual Northern Blot技术进行验证，达到了>90%的吻合率[4]。而本实验中采用RT?PCR方法进行验证，吻合率达到86%，略低于文献报道。分析其原因有：（1）RT?PCR方法的特异性不如Northern Blot，假阳性率稍高，由于扩增出假阳性条带使差异变得不显著；（2）普通PCR到达反应平台期的时间不容易控制，如果进行了过多的循环，两者均达到平台期后，则会降低样本之间的差异性；（3）由于RNA样本量所限以及重复克隆、互补克隆的存在，仅对其中的14条序列进行了验证。假设RNA量充足，能够对所有筛选出来的序列进行验证，不仅扩大了样本量，同时由于重复克隆和互补克隆的存在使阳性率进一步提高，因此，吻合率将会>86％。综合以上原因，考虑本实验样本来源于稀缺珍贵的家族性白血病患者，RNA量有限，无法满足Northern Blot对实验样本的需求；经过实践验证，笔者认为RT?PCR方法吻合率高，操作简便，不失为一种良好的替代方法，能够最大限度地获得所需信息。

    本实验应用抑制性消减杂交与差异筛选技术筛选出28个基因片段为差异表达基因，与GenBank进行同源性比对分析后发现，其中17个为已知基因，涉及基因转录、翻译、DNA损伤修复、依赖细胞周期蛋白激酶、细胞周期蛋白、蛋白酶抑制因子等有关基因，均与细胞的增殖和分化有关，这也从另一方面证实了DIG?dUTP标记探针进行差异筛选技术筛选的可靠性[5?12]；另外11个为未知基因EST片段。这些结果对于进一步研究急性髓系白血病发病的分子机制具有重要意义。

【文献】
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