老年人胃癌肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态

              作者：蔡建春， 刘棣， 张海萍， 钟山， 夏宁邵

【摘要】  目的分析老年人胃癌组织及其癌旁小凹上皮和慢性胃炎小凹上皮中肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）方法，检测51例老年人胃癌及其癌旁小凹上皮和15例慢性胃炎小凹上皮石蜡标本中E钙黏素（E?CD）、错配修复酶hMLH1、APC和6?氧?甲基鸟嘌呤?DNA甲基转移酶（MGMT）基因启动子区甲基化状态。结果在胃癌组织及其癌旁小凹上皮和慢性胃炎小凹上皮中，基因总的甲基化率分别为70.6%（36/51例）、47.0% (24/51例) 和6.6％（1/15例），三者之间差别有统计学意义（P＜0.01）。Lauren弥漫型、Ming浸润型、低分化和未分化、Ⅲ期和Ⅳ期、T3和T4以及有淋巴结转移胃癌的甲基化率分别高于Lauren肠型、Ming膨胀型、高和中分化、Ⅰ期和Ⅱ期、T1和T2以及无淋巴结转移胃癌的甲基化率（均P＜0.05）。结论E?CD、hMLH1、APC和MGMT基因启动子区甲基化在慢性胃炎小凹上皮中少见，在癌旁小凹上皮中频繁出现，在胃癌组织中普遍存在，提示甲基化可能是胃癌发生的早期事件。

【关键词】  遗传学研究； 甲基化； 胃肿瘤； 基因，肿瘤抑制癌基因

    真核生物基因启动子区甲基化参与基因的表达调控、调节胚胎发育、基因组印迹和X染色体灭活，甲基化异常与衰老、肿瘤密切相关，对一些肿瘤相关基因的研究证实了这一点[1]。胃癌是老年人的常见病、多发病，且随着年龄的增长发病率上升。笔者探讨老年人上述组织E钙黏素（E?CD）、错配修复酶hMLH1、APC和6?氧?甲基鸟嘌呤?DNA甲基转移酶（MGMT）基因启动子区甲基化状态。

    1材料与方法

    1.1材料

    1.1.1标本选自2002年12月～2006年2月手术切除胃癌石蜡标本51例，胃镜活检慢性胃炎小凹上皮石蜡标本15例，行常规组织切片,H?E染色和病理诊断。51例中, 男性42例，女性9例，年龄（68.8±2.65）岁（60～83岁）。临床病理分期（按国际抗癌联盟1997年pTNM分期标准）[2]：Ⅰ、Ⅱ期11例，Ⅲ、Ⅳ期40例；病理分级：高、中分化腺癌20例，低分化腺癌27例，未分化癌和印戒细胞癌4例；Lauren肠型20例，弥漫型31例；Ming膨胀型24例，浸润型27例。实验方案经患者知情同意签署和院伦理委员会批准。

    1.1.2主要试剂CpGenome DNA修饰试剂盒(美国&加拿大Chemicon公司)；Taq DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)；引物由上海英俊生物技术公司合成；B淋巴瘤细胞株Raji和人宫颈癌细胞株Hela引自美国模式菌种收集中心（ATCC）。

    1.2方法

    1.2.1DNA提取按胃癌组织、癌旁5 cm小凹上皮和慢性胃炎小凹上皮分成3组。在显微镜下进行观察、标记，采用[3]方法取出上述组织，分别放入1.5 mL离心管，加入裂解缓冲液200 μL(10 mmol/L Tris?HCl, pH 8.0, 100 mmol/L KCl, 2.5 mmol/L MgCl2?6H2O, 0.45% Tween?20）和蛋白酶K溶液30 μL（20 mg/mL），在56 ℃条件消化12～16 h，4 ℃离心（12 000 r/min），吸出上清液，移至新的离心管，-20 ℃保存。

    1.2.2DNA亚硫酸氢盐修饰取已抽提的DNA(10 ng/μL) 1.0 μg，按照CpGenome DNA修饰试剂盒的操作步骤进行。

    1.2.3MSP反应采用套式PCR，总反应体系：DNA 2.0 μL,正向引物0.2 μL，反向引物0.2 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，dNTP 0.2 μL，10×缓冲液2 μL，加三蒸水至20 μL。每次反应都采用Raji细胞株作为阳性对照，Hela细胞株作为阴性对照。PCR反应条件：预变性5 min，95 ℃ 30 s→30 s→72 ℃ 30 s，35循环，72 ℃再延伸10 min(表1)。

    1.2.4产物鉴定及结果判定配制3%琼脂糖凝胶，PCR产物用溴酚蓝染色，取产物5～10 μL，加样于琼脂糖凝胶加样孔，置于电泳槽中电泳，电泳缓冲液为1×TAE，电压180 V。当溴酚蓝条带迁移至琼脂糖凝胶2/3处时终止电泳，紫光灯下观察电表1肿瘤抑制基因启动子区甲基化和非甲基化PCR引物泳条带，凝胶成像仪采集图像。E?CD、hMLH1、APC和MGMT基因启动子区甲基化和非甲基化电泳条带大小(bp)分别为167和178，124和118，97和108，81和93。若甲基化引物扩增出现条带，说明该病例发生甲基化，若非甲基化引物扩增出现条带，说明该病例处于非甲基化状态。

    1.3统计学处理数据处理采用SPSS 12.0软件包。采用Fisher精确检验，P＜0.05为差别有统计学意义。

    2结果

    2.1肿瘤抑制基因启动子区甲基化状况15例慢性胃炎小凹上皮中，仅1例有1个基因甲基化。癌旁小凹上皮中，有1个基因甲基化和≥2个基因甲基化的病例分别为33.3%（17/51例）、13.7%（7/51例）。胃癌组织中，有1个基因甲基化和>2个基因甲基化的病例分别为23.5%（12/51例）、47.1%（24/51例）。胃癌组织总甲基化率（70.6%）明显较癌旁小凹上皮和慢性胃炎小凹上皮甲基化率（47.0%和6.6%）高,三者比较差别有统计学意义（P＜0.01）（图1）。

    2.2胃癌组织肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态与临床病理参数的关系男性与女性胃癌的甲基化率比较差别无统计学意义（P＞0.05）；而Lauren弥漫型胃癌、Ming浸润型胃癌、分化不良(低分化)胃癌、未分化和印戒细胞胃癌、Ⅲ期和Ⅳ期胃癌、T3和T4胃癌以及有淋巴结转移胃癌的甲基化率分别高于Lauren肠型胃癌、Ming膨胀型胃癌、分化良好(高、中分化)胃癌、Ⅰ期和Ⅱ期胃癌、T1和T2胃癌以及无淋巴结转移胃癌的甲基化率，二者比较差别有统计学意义（P＜0.05,表2）。

    N:癌旁小凹上皮;T:胃癌组织;M:用甲基化引物进行MSP扩增;U:用非甲基化引物进行MSP扩增;N和T前面的数字表示病例序号.

    图1MSP测定胃癌及其癌旁小凹上皮肿瘤抑制基因启动子区甲基化的电泳 表 2老年人胃癌肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态与临床病理参数的关系表中数据为例数.组内比较,☆:P＜0.05,☆☆:P＜0.01.

    3讨论

    胃癌是老年人的常见病、多发病，它的发生、是一个多阶段、多因素参与的过程。在此过程中,除了遗传学的作用外,表遗传学也起着重要的作用。肿瘤抑制基因启动子区甲基化将引起其转录沉默而失去抑癌功能[1]。越来越多的研究表明，肿瘤抑癌基因启动子区甲基化引起基因失活，与肿瘤的发生、发展密切相关[3?8]。本研究发现，甲基化在慢性胃炎小凹上皮中少见，在癌旁小凹上皮中频繁出现，在胃癌组织中普遍存在，说明甲基化在胃癌的发生前就出现，它可能是胃癌发生的早期事件。

    E?CD是一种肿瘤抑制基因，在细胞间的连接、维持细胞分化及正常上皮组织结构起到重要作用；hMLH1和MGMT属DNA错配修复基因，APC是1990年代初克隆、分离和鉴定的肿瘤抑制基因。这4个基因从不同的途径对肿瘤的发生、发展起着抑制作用,起动子区的甲基化可能影响基因的表达。进一步检测其他基因起动子区甲基化状态，将能寻找出更多的指标，为胃癌的早期诊断、预后判断、指导临床综合提供。笔者分析上述4个基因起动子区总甲基化率与老年人胃癌的关系发现，甲基化状态与胃癌的Lauren分型、分化程度有关，即Lauren弥漫型胃癌的甲基化率明显高于Lauren肠型胃癌的甲基化率，低分化、未分化胃癌的甲基化率明显高于高分化胃癌的甲基化率，结果与报道相似[9?11]。甲基化状态与胃癌的pTNM分期、浸润深度和淋巴结转移均有关，但结果与Tamura和Lee的报道相反，他们认为甲基化率在早期胃癌和进展期胃癌中没有差别，甲基化率与pTNM分期无关[12?13]。本组资料分析还发现，甲基化率与胃癌的Ming分型有关、但与病人性别无关。造成这些相反结果的原因可能是老年人胃癌表现不同，研究的基因及其数目不同，或者是人类种族不同所致。

    分析单个基因起动子区甲基化率与老年人胃癌的关系发现，仅E?CD基因启动子区甲基化率在预后良好的Ming膨胀型胃癌组织中较在预后不良的浸润型胃癌组织中高，而在其它3个基因中差异没有差别，提示E?CD甲基化与胃癌的生物学行为有一定的关系。笔者以前研究也发现E?CD蛋白在Ming浸润型胃癌中的表达明显减弱或消失[14]，这是由于E?CD基因改变还是基因启动子区甲基化抑或是其它原因造成的有待进一步研究。

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