雷公藤内酯醇体内外抗肿瘤作用

          作者：王恒邦, 许建华, 温彩霞 黄秀旺, 陈元仲 

【摘要】  目的研究雷公藤内酯醇(TPL)的体内外抗肿瘤作用。方法应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测TPL对多种肿瘤细胞生长的抑制作用;不同浓度TPL(25,50及100 ng/mL)处理HL?60细胞24 h后,Annexin V?FITC/PI荧光染色法检测凋亡率,分光光度法检测细胞caspase?3酶活化程度;建立S180、U14、B16小鼠移植肿瘤模型进行体内实验,观察TPL体内抗肿瘤活性。结果TPL对MCF?7、HL?60、MGC?803、HepG?2、U266、Ca?46、Hela等多种人肿瘤细胞均有很强的生长抑制作用,其IC50 分别为34.37,5.51,31.95,6.31,9.74,26.96及9.75 ng/mL;TPL实验组凋亡细胞百分率显著上升,caspase?3酶活化程度明显升高;对S180、U14、B16 等小鼠肿瘤均有明显抑制作用,抑制率分别达到61.0%,41.8%及58.0%。结论TPL体内体外均有较强抗肿瘤作用,其机制与激活caspase?3诱导肿瘤细胞凋亡有关。

【关键词】  雷公藤内酯; 抗肿瘤药,植物; 细胞凋亡; 肿瘤

    雷公藤内酯醇(triptolide,TPL)由卫矛科植物雷公藤根(去皮)提取、精制而成,是其主要活性成分之一,具有抗炎、免疫抑制和抗生育等多种药理作用,广泛用于自身免疫性疾病、器官移植等。研究发现在体外实验中TPL具有很强的抗肿瘤活性[1?4]。笔者采用MTT法、荧光染色法、分光光度法及应用小鼠移植肿瘤模型对其体内外抗肿瘤作用及其机制作进一步研究。

    1材料与方法

    1.1材料

    1.1.1药品及试剂TPL由福建医科大学药学院天然药物系提供,样品经高效液相色谱分析纯度约99.9％,于实验前以丙二醇(1 mg/mL)新鲜配制,使用时以培养液稀释至所需浓度(丙二醇终浓度≤0.01％），微孔滤膜(0.22 μm)除菌。依托泊苷注射液(VP?16,江苏恒瑞医药股份有限公司,批号:vp051202);丙二醇(国药集团化学试剂有限公司,批号:20041026);RPMI?1640、胎牛血清(美国Gibco公司);MTT(美国Sigma);Annexin V?FITC细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技有限公司,批号:060526);caspase?3分光光度法检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司,批号:060830)。

    1.1.2细胞株及动物MCF?7、HL?60、MGC?803、HepG?2、U266、Ca?46、Hela等人肿瘤细胞由本研究所冻存提供。细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中(含青霉素100 U/mL,链霉素100 mg/L),置37 ℃、体积分数为0.05的CO2的培养箱。普通级昆明小鼠[福建医科大学实验动物中心,合格证号:SCX(闽)2004?002],清洁级C57小鼠[上海斯莱克实验动物有限公司,合格证号scxk(沪)2003?0003],雌雄不拘,体质量(18±2)g。

    1.1.3仪器流式细胞仪(EPICS?XL,美国Backman公司);紫外分光光度计(Cary?50,美国Varian公司)。

    1.2方法

    1.2.1MTT法检测将对数生长期的肿瘤细胞以1.5×104mL?1接种于96孔培养板中,每孔200 μL,每组重复3孔。实验组加入不同浓度的TPL(2.5,5.0,10,20,50及100 ng/mL),对照组加入等体积(含0.01％丙二醇)RPMI 1640溶液(贴壁细胞预培养24 h贴壁后加药)。TPL作用48 h后加入MTT(5 mg/mL)继续培养4 h,小心吸弃上清液,加入DMSO 150 μL振荡溶解完全,酶标仪检测D(570 nm),根据下列公式抑制率并计算IC50:

    抑制率＝1-(实验组D值/对照组D值)×100%

    1.2.2流式细胞仪检测取对数生长期的HL?60细胞以5×105mL?1接种于6孔板,实验组分别加入25,50或100 ng/mL的TPL,对照组加入等体积(含0.01％丙二醇)RPMI 1640溶液,作用24 h后收集细胞,按Annexin V?FITC/PI双染用流式细胞仪检测凋亡率,按试剂盒说明书操作。

    1.2.3TPL对caspase?3酶活性的影响细胞处理同1.4.2,作用24 h后收集细胞,按caspase?3分光光度法检测试剂盒说明书操作,紫外分光光度计检测D值(405 nm),计算活化程度:

    活化程度＝实验组D值/对照组D值

    1.2.4TPL的体内抗肿瘤作用参照[5],建立S180、U14和B16小鼠肿瘤移植模型(每只接种细胞3×106)。经预实验已摸索出TPL尾静脉给药隔天1次的最大耐受量为0.35 mg/kg。次日按体质量随机分成TPL实验组(TPL 0.0875,0.175及0.35 mg/kg),阴性对照组(1.5％丙二醇),阳性对照组(VP?16 4 mg/kg)。尾静脉给药,隔天1次,连续5次,停药24 h后脱颈处死,剥瘤称质量并计算抑瘤率:

    抑瘤率(%)=(1-T/C)×100%

    T/C:治疗组平均瘤质量/对照组平均瘤质量。

    每次实验重复2次。

    1.3统计学处理数据以x±s表示,采用Microsoft Excel 2000软件中的Student t检验。

    2结果

    2.1对肿瘤细胞的生长抑制作用TPL对MCF?7、HL?60、Ca?46、HepG?2、MGC?803、U266及Hela等肿瘤细胞均有很强的生长抑制作用,不同浓度的TPL作用于肿瘤细胞48 h以后,随着TPL剂

    量的增加,细胞存活率显著下降,对肿瘤细胞生长抑制率显著上升( 图1);其半数细胞抑制浓度(IC50)分别为34.37,5.51,26.96,6.31,31.95,9.74与9.75 ng/mL。

    图1TPL抑制肿瘤细胞的量效关系曲线

    Fig 1Dose?effect relationship of TPL on the proliferation of tumor cells

    2.2凋亡率对照组HL?60细胞凋亡率为7.02％(早期4.22%,晚期2.80%);不同浓度TPL(25,50和100 ng/mL)处理的HL?60细胞凋亡率分别为65.96％(早期8.16%,晚期57.8%),58.22％(早期8.52%,晚期49.7%),78.8％(早期10.2%,晚期68.6%)。流式细胞仪检测结果见图2。

    A:对照组; B~D:雷公藤内酯醇25,50,100 ng/mL.

    图2流式细胞仪检测结果(Annexin V?FITC和PI双染法)

    Fig 2The apoptosis rates of HL?60 exposed to TPL in different concentration for 24 hours

    2.3对caspase?3酶活性的影响经不同浓度TPL(25,50,100 ng/mL)处理HL?60细胞24 h后caspase?3酶活性明显提高,分别是对照组细胞的1.65,2.14和2.36倍,且随着浓度增加其活化程度也相应增加,呈剂量依赖性(表1)。

    2.4体内抗肿瘤作用TPL对小鼠移植性肿瘤S180、U14和B16均有明显的抑制作用,差别有统计学意义,具有一定的量效关系(表2)。在实验过程中,TPL大剂量组虽有个别小鼠死亡,但在整个实验过程中小鼠无体质量明显下降、松毛、腹泻等中毒症状出现。 表1不同浓度雷公藤内酯醇对caspase?3酶活性的影响 表2雷公藤内酯醇对小鼠S180、U14、B16的抑制作用TPL:雷公藤内酯醇(mg/kg); VP?16:依托泊苷(4 mg/kg).同一模型中，与对照组(1.5%丙二醇)比较,☆:P<0.05,☆☆:P<0.01.

    3讨论

    3.1TPL体内外对肿瘤细胞的生长抑制作用TPL是从雷公藤提取出来的一种活性成分,具有抗炎、免疫抑制、抗生育及抗肿瘤等多种药理作用。笔者采用MTT法观察TPL对MCF?7、HL?60等多种人肿瘤细胞的生长抑制作用,其半数细胞抑制浓度(IC50值)均<40 ng/mL,显示出很强的抗癌活性;同时体内实验结果也表明TPL对小鼠移植肿瘤S180、U14、B16均显示出较强的抗肿瘤作用,说明TPL在体内外均有很强的抗肿瘤作用,显示出广谱高效的优越性,有望成为新一代的抗肿瘤药物。

    3.2TPL抗肿瘤作用机制迄今为此,TPL的抗肿瘤作用机制尚不明确。许建华等早期研究认为,TPL对肿瘤细胞的DNA、RNA合成均有抑制作用,且对DNA合成的抑制更显著;通过对肿瘤细胞核苷转运体系的抑制从而抑制细胞补救通路DNA的合成[6]。近年有研究认为,TPL能通过多种途径诱导肿瘤细胞凋亡。Choi等发现,用TPL 25 nmol/L作用于U937人幼单核细胞24 h,细胞可出现凋亡的形态学表现[7]。Yang等研究发现,TPL可以激活凋亡途径中两个关键分子caspase 3和多聚ADP?核糖聚合酶,用TPL处理MDA?435细胞2 d后,发生切割的caspase?3明显增加,该酶发生了从完整的分子到亚单位的转换[8]。Carter等研究发现TPL通过线粒体途径激活caspase?3、caspase?8诱导多种白血病细胞凋亡[9]。在本实验中,笔者发现不同浓度的TPL(25,50和100 ng/mL)处理HL?60细胞24 h后,凋亡率明显提高,且caspase?3酶活性也显著提高，该结果与上述报道相符。

    caspase?3是细胞凋亡信号传导途径中的关键执行分子,与DNA断裂、染色质凝聚和凋亡小体形成有关。caspase?3在正常状态下以酶原形式存在于细胞质中,没有活性;但在细胞发生凋亡阶段,caspase?3被激活,活化的caspase?3裂解相应的细胞质与细胞核底物,最终导致细胞凋亡。caspase?3活化程度的显著提高表明TPL能激活caspase?3,从而诱导肿瘤细胞凋亡发挥其抗肿瘤效应。由此可见,TPL的抗肿瘤机制涉及到抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制细胞DNA、RNA合成等方面。但有关其诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制以及其是否还有其他途径发挥抗肿瘤作用尚需进一步研究。

    3.3TPL的毒性TPL药理作用广泛,抗癌活性明显,但其毒副作用也较大。笔者发现,TPL实验组无体质量明显下降、松毛、腹泻等中毒症状出现,与对照组比较体质量下降的差别无统计学意义(P>0.05),但高剂量组存在个别动物死亡情况。在预试验中发现TPL有效剂量与中毒剂量的范围相对较窄,指数相对偏低,这一缺陷也限制了其体内抗肿瘤效应的发挥。丁虹等发现TPL雄性小鼠腹腔给药的LD50及口服给药的LD50分别为0.725与0.788 mg/kg;TPL所致的急性毒性的主要死亡原因为急性肝坏死[10]。笔者对实验中中毒致死的小鼠进行尸检,发现小鼠肝脏呈灰色或灰白色,提示急性肝损伤可能是TPL急性毒性的机制之一。阐明TPL的毒性机制,有效地进行结构改造以降低TPL的毒副作用,充分发挥TPL高效广谱的优越性,需进行深入研究。

    TPL在体内外均有较强的抗肿瘤作用,该作用与激活caspase?3诱导肿瘤细胞凋亡有密切关系。因受制于其自身缺陷,在本研究中TPL体内抗肿瘤作用不及体外显著,但其体内给药剂量可为进一步研究其体内抗肿瘤作用和毒性特点提供剂量。

【参考】
  [1]Wan C K,Wang C,Cheung H Y,et al. Triptolide induces Bcl?2 cleavage and mitochondria dependent apoptosis in p53?deficient HL?60 cells[J]. Cancer Lett, 2006,241 (1):31?41.

[2]Miyata Y,Sato T,Ito A,et al. Triptolide,a diterpenoid triepoxide,induces antitumor proliferation via activation of c?Jun NH2?terminal kinase 1 by decreasing phosphatidylinositol 3?kinase activity in human tumor cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005,336(4):1081?1086.

[3]高小平,李伯刚,周建,等. 雷公藤内脂醇体外抗瘤作用和诱导细胞凋亡的研究[J]. 天然产物研究与开发, 1999,12(1):18?21.

[4]Lou Y J,Jin J. Triptolide down regulates bcr/abl expression and induces apoptosis in chronic myelogenous leukemia cells[J]. Leuklymphoma, 2004,45(2):373?376.

[5]徐叔云. 药理实验方法学[M]. 2版, 北京:人民卫生出版社, 1991:1446?1449.

[6]许建华,李常春,黄自强. 雷公藤内酯醇对L1210细胞补救通路DNA合成的影响[J]. 福建医学院学报, 1993,27(4):281?284.

[7]Choi Y J,Kim T G,Kim Y H,et a.Immunosuppressant PG490(triptolide) induces apoptosis through the activation of caspase?3 and down regulation of XIAP in U937 cells[J]. Biochem Pharmacol, 2003,66(2):273?280.

[8]Yang S,Chen J,Goo Z,et al. Triptolide inhibits the growth and metastasis of solid tumors[J]. Mol Cancer Ther, 2003,2(1):65?72.

[9]Carter B Z,Mak D H,Schober W D,et al. Triptolideinduces caspase?dependent cell death mediated via the mitochondrial pathway in leukemic cells[J]. Blood, 2006,108(15):630?637.

[10]丁虹,吴建元,童静,等. 雷公藤甲素急性毒性及其机制研究[J]. 中药材, 2004,27(2): 115?118.