p53和血管内皮生成抑素基因共转染对HL60细胞生长的影响

【摘要】  目的观察p53和血管内皮生成抑素基因(AS)共转染对HL60细胞生长和血管内皮生长因子(VEGF)、bax、bcl?2表达水平的影响,探讨联合基因急性白血病的可能性。方法选用脂质体将p53+AS转染HL60细胞,以RT?PCR法检测转染后细胞目的基因的表达。通过细胞集落形成实验、MTT试验及流式细胞仪观察p53+AS转染后对HL60细胞生长的影响。采用RT?PCR及免疫组织化学检测p53+AS转染后HL60细胞的VEGF、bcl?2与bax表达的改变。结果p53+AS转染成功并在HL60细胞中稳定表达,明显抑制细胞的生长,协同促进凋亡,使细胞的VEGF和bcl?2表达下降,bax表达升高。结论p53+AS转染对HL60细胞生长具有明显的抑制作用,两者存在协同效应,其机制可能是影响bcl?2/bax。

【关键词】  基因； p53; 血管抑制素类; 白血病; HL60细胞; 细胞凋亡

    基因疗法是近年来肿瘤治疗的热点,但效果不理想。原因之一是肿瘤的发生、是一个复杂的过程,涉及到多基因的异常以及各种其他因素的作用,单一基因治疗只能作用于肿瘤发生、发展过程中的某一个环节,只有相关的基因共同作用才能更为有效地抑制肿瘤。p53基因是重要的抑癌基因。野生型p53蛋白对细胞周期有重要调控作用,能在DNA受损时促使DNA修复,甚或诱导细胞凋亡。血管内皮生成抑素(angiostatin,AS)对多种肿瘤的生长具有抑制作用,虽然它对肿瘤细胞本身没有直接作用,但可通过抑制或阻断碱性成纤维生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)而抑制供应肿瘤组织营养物质的血管内皮细胞的增殖、迁移、并促其凋亡,从而抑制肿瘤组织内新生血管的生成。笔者观察p53、AS共转染对HL60细胞生长的影响,为白血病基因联合治疗提供理论依据。

    1材料与方法

    1.1材料

    1.1.1细胞HL60细胞(福建医科大学药研究所提供)生长于内含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中,37 ℃、体积分数为0.05的CO2的饱和湿度培养箱中培养。

    1.1.2基因和试剂携带野生型p53基因、AS基因载体pVITRO2?p53?Angio(美国Invivogen公司)。筛选抗生素潮霉素(美国Invivogen公司);RNA提取试剂盒Trizol(美国Gibco公司);Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司);质粒抽提试剂盒(Qiagen Plasmid Midi,德国Qiagen公司);小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);RPMI 1640(美国Gibco公司)。RT?PCR引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)逆转录试剂(美国Promega公司);免疫组织化学试剂(武汉博士德生物工程有限公司)。

    1.2方法

    1.2.1细胞转染培养大肠杆菌E.coli GT116(质粒载体)扩增质粒,按质粒抽提试剂盒说明书操作;设空载体组、p53组、AS组和p53+AS组,分别取pVITRO2、pVITRO2?p53、pVITRO2?Angio和pVITRO2?p53?Angio质粒各2 μg,与Lipofectamine 2000 5 μL混匀,静置20 min,加入HL60培养板进行转染;加入200 μg/mL潮霉素筛选,抗性细胞继续培养扩增。

    1.2.2细胞集落形成实验取对数生长期细胞以每孔150 0.5 mL?1的密度接种于24孔培养板,培养2~3周,肉眼可见集落后加Giemsa应用液200 μL染色20 min,流水洗去染液,干燥后细胞集落数。

    1.2.3绘制细胞生长曲线取对数生长期的4种细胞按每孔1 000的密度接种于96孔板上,分别于接种后24,48,72 h，前4 h加入5 mg/mL MTT溶液20 μL,37 ℃孵育4 h,常温下500 r/min离心,用酶标仪测定D(490 nm)值,以D(490 nm)为纵坐标,以时间为横坐标绘制生长曲线。

    1.2.4检测细胞周期收集各组细胞(密度为1×106 mL-1)送流式细胞仪检测,分析细胞周期。

    1.2.5RT?PCR

    p53: 5’CAGCCAAGTCTGTGACTTGCCGTAC

    3’CTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATC

    94 ℃ 3 min(94 ℃ 30 s→56 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s)×30

    Ang:5’GAACTACAGAGGGACGATGTCCTC

    3’CAGAAGATGGTGGAGGTGTTG

    94 ℃ 3 min(94 ℃ 20 s→58 ℃ 30 s→72 ℃ 20 s)×35为引物,进行RNA提取和逆转录,行PCR扩增,取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外灯下观察结果并拍照。

    1.2.6VEGF、bcl?2和bax免疫组织化学检测细胞经PBS冲洗、晾干后,加入DAB显色试剂盒中各1滴,经苏木精对比染色,盐酸返蓝,封固,按试剂盒说明书操作。VEGF、bcl?2和bax均以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性。

    1.3统计学处理测定值以x±s表示,SPSS 10.0统计软件分析,多组间均数比较用单因素方差分析,组间两两比较用最小显著法。

    2结果

    2.1细胞转染RT?PCR电泳显示,p53、AS在HL60细胞中共转染成功并稳定表达，在355 bp左右出现两条特异性条带,分别为p53、AS的扩增片段(图1)。

    M:Marker; AS:血管内皮生成抑素基因

    图1p53、AS在HL60细胞转染后RT?PCR电泳

    Fig 1p53 and AS transfection and expression in HL60 cell

    2.2细胞集落形成p53、AS和p53+AS组明显抑制HL60细胞的生长,表现为细胞集落形成数减少(P<0.05),其中以p53+AS组最为明显(P<0.05,图2，表1）。

    2.3细胞周期流式细胞仪分析,p53+AS组能协同抑制HL60细胞的增殖,使细胞停滞于G1期(表1)。

    2.4VEGF、bcl?2、bax表达(1)VEGF:p53+AS组转染前HL60细胞VEGF强阳性表达,细胞质存在大量棕黄色颗粒,转染后仅少数HL60细胞细胞表24组HL60细胞生长曲线(MTT)表24组HL60细胞凋亡质可见浅黄色颗粒,表达水平下降。(2)bcl?2:转染前HL60细胞bcl?2表达为强阳性,细胞质存在大量强染色特异性颗粒,转染后细胞质内几乎不出现特异性颗粒,表达水平明显下降。(3)bax:转染前HL60细胞bax阳性表达低,细胞质有少量棕黄色颗粒,转染后细胞质出现大量棕黄色颗粒,bax表达水平明显升高(图3)。

    3讨论

    急性白血病是造血系统最常见的恶性肿瘤,目前仍以化疗为主,不断出现的耐药现象极大地困扰着该病的治疗。近年来,基因靶向治疗越来越受到关注,成为研究的一大热点。

    3.1p53和AS基因对白血病的作用机制与作用部位野生型p53可下调VEGF的表达[1],抑制血管生成,引起肿瘤休眠;血管新生以及VEGF在白血病等血液病的生长、增殖过程中起着重要作用[2],且与疾病的分期、预后有关。费嘉等研究设计的VEGF mRNA反义核酸能有效地抑制K562细胞增殖,证实了内源性VEGF蛋白具有促进K562细胞增殖的功能;同时说明抑制VEGF蛋白表达不仅可以抑制肿瘤血管新生,还可以抑制肿瘤细胞自身增殖,即具有双重抑制机制[3]。但其对肿瘤细胞本身作用机制尚不明确。O’Reilly等发现能强烈抑制血管内皮细胞生长和血管新生的血管抑素以来,

    A:转染前; B:转染后. VEGF:血管内皮生长因子; AS:血管内皮生成抑素基因.

    图3p53+AS组HL60细胞免疫组织化学表现(×400)

    Fig 3HL60 cell immunochemistry(×400)

    其生物学效应和作用方式立即引起人们极大地关注[4]。近年的研究结果表明[5?7],p53和AS基因对白血病HL60细胞的生长具有明显的抑制作用。p53和AS基因的作用机制与作用部位不同,p53不仅能促进细胞凋亡,而且也抑制新生血管的生成,可以增强AS的抗血管生成;AS抑制血管,阻断肿瘤细胞的代谢和转移途径,能增强p53抗肿瘤的“旁观者”效应;两者在抗肿瘤增殖方面存在协同效应。

    3.2p53+AS基因共转染对HL60细胞生长的影响p53+AS基因共转染对HL60细胞生长具有明显的抑制作用并存在协同效应,表现为p53和AS基因转染后,HL60细胞的形态发生改变,生长速度变慢,倍增时间延长,细胞集落形成数减少,死亡加快,各组两两比较,P<0.05,以p53+AS组最为明显。本研究表明,p53和AS基因对HL60细胞的生长具有抑制作用,p53+AS基因共转染对HL60细胞生长的抑制效果明显优于p53或AS基因单独转染,说明这两种基因在抑制HL60细胞的生长方面存在协同效应。

    3.3p53+AS基因共转染对HL60细胞VEGF、bcl?2、bax表达的影响p53+AS共转染使HL60细胞的VEGF、bcl?2表达水平下降,bax表达水平明显升高,bcl?2/bax的比率下降。笔者研究结果表明,VEGF表达水平改变,影响HL60细胞自身增殖而达到抗肿瘤的作用;bcl?2表达水平改变,通过促进HL60细胞凋亡、缩短HL60细胞生存期也达到相同作用。笔者认为，bcl?2/bax的比率下降可能是抑制HL60细胞生长的机制之一。

    在今后的白血病治疗中,联合多基因治疗是一个必然的方向,将有利于解决白血病治疗的耐药问题,本研究结果有助于探讨以减少肿瘤新生血管为靶向的联合基因治疗的新途径。

【】
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