鼻咽癌差异表达miRNAs筛选研究
作者：李晓霞， 李瑞平， 杜紫明， 曾木圣， 邵建永
【摘要】 【目的】应用miRNAs芯片筛选原代培养的鼻咽癌细胞差异表达miRNAs，并寻找差异表达miRNAs调控的靶基因，为进一步研究其在鼻咽癌发病机制中的作用打下基础。【方法】 运用miRNAs芯片技术筛选原代培养的鼻咽癌细胞差异表达miRNAs，同时运用miRNAs特异的引物组对差异表达的miRNAs进行荧光定量RT PCR验证。运用靶基因预测软件并结合全基因组表达谱芯片结果预测差异表达miRNAs可能调控的靶基因，并利用western blot技术检测预测的靶基因在原代培养的鼻咽癌细胞中的表达。【结果】 miRNAs芯片结果显示，鼻咽癌中miR-203、miR-503、miR-424、miR-141和miR-148a表达下调，而miR-25、miR-195和miR-15a表达上调，其差异表达均在2倍以上；荧光定量RT PCR结果与miRNAs芯片的结果较符合；其中miR-203的预测靶基因为CCNG1和SPARC，Western blot结果显示，其在原代培养的鼻咽癌细胞亦高表达。【结论】 miR-203、miR-503、miR-424、miR-141、miR-148a、miR-25、miR-195、miR-15a在原代培养的鼻咽癌细胞与正常鼻咽上皮细胞中存在差异表达；CCNG1和SPARC可能是miR-203调控的靶基因，可能参与了鼻咽癌的发生。
【关键词】 microRNA； 鼻咽癌； 差异表达
Abstract：【Objective】 To investigate the differentially expressed miRNAs and their target genes in primary nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells, which are useful for further studies on functions of miRNAs in pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma. 【Methods】 MicroRNA microarray was used to investigate the differentially expressed miRNAs in primary NPC cells, and the discovered miRNAs were confirmed by real time RT-PCR assay. Furthermore, we predicted the possible target genes by combination anticipated algorithms and the whole expression profile of genome from primary NPC cells. Western blot was performed to detect the expression of the predicted target gene in primary NPC cells. 【Results】 MicroRNA microarray showed that expression of miR-203, miR-503, miR-424, miR-141, and miR-148a were down-regulated in primary NPC cells by two folds, while expression of miR-25, miR-195, and miR-15a were up-regulated by more than two folds too, which was accordant with the results from real time RT-PCR. CCNG1 and SPARC, the predicted target genes of miR-203, were detected to be high expressed in primary NPC cells by Western blot assay. 【Conclusion】 MiR-203, miR-503, miR-424, miR-141, miR-148a, miR-25, miR-195, and miR-15a were differentially expressed between NPC and NPNE cells. CCNG1 and SPARC, the putative target genes of miR-203, may play an important role in the pathogenesis and development of NPC.
miRNAs (microRNA)是一类高度保守的非编码小RNA（nod-coding small RNA），一般为19～25nt的单链型RNA，由60～110nt的可形成发夹状的内源性转录前体加工而成。它们广泛存在于植物、动物以及病毒中[1]。miRNA与靶mRNA的3’UTR碱基配对，通过抑制mRNA的翻译[2]或直接使mRNA降解[3]，在转录后水平使基因产生沉默。越来越多的证据显示由miRNA调节的基因调控机制作为基因表达水平调控的一种重要方式，与肿瘤的发生密切相关，miRNAs很可能是一类潜在的癌基因或抑癌基因。对慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)的研究发现mir-15a和mir-16-1位于13q14染色体缺失域，50%～60%的CLL的患者存在mir-16-1和/或mir-15a的表达下调[4]，而miR-143和miR-145在结肠癌中表达下调[5]，Let-7在肺癌细胞中表达下调，RAS可能受到Let-7的调控[6]，并且50%以上的miRNAs的基因位于在人类癌症中发生缺失、扩增的染色体区域或染色体脆性位点，进一步表明了miRNAs与人类癌症的相关性[7]。鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）是我国南方地区常见的恶性肿瘤。目前认为，遗传因素、EB病毒感染和某些环境因素与鼻咽癌的发生有关[８]，但具体的分子发生机制尚不清楚。本研究应用miRNAs芯片筛查了原代培养的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞差异表达的miRNAs，并在对差异表达的miRNAs进行靶基因的预测的基础上进一步对其靶基因进了行验证，为进一步研究其在鼻咽癌发病机制中的作用打下基础。
1 材料和方法
1.1 材 料
5例原代培养鼻咽癌细胞（NPC8、NPC31、NPC43、NPC44和NPC47）及5例原代培养鼻咽正常上皮细胞（NPNE5、NPNE7、NPNE10、NPNE12和NPNE13）标本均来源于中山大学肿瘤防治中心鼻咽科门诊。患者均为未接受过的门诊病人。鼻咽癌细胞株C666由中山大学附属肿瘤防治中心实验研究部冻存。
1.２ 方 法
1.２.1 细胞培养 鼻咽原代细胞的培养方法参见[１]，其中用于芯片的鼻咽原代细胞均经过生物学特性的鉴定（资料未发表）。C666细胞用RMPI 1640培养基（含有10%的FBS、50 mg/L 链霉素和50 mg/L青霉素），细胞置于37 ℃，5%CO2的培养箱中。
1.２.２ 小分子RNA样品的分离与荧光标记 取对数生长期细胞，Trizol一步法提取细胞总 RNA，异丙醇沉淀法浓缩 RNA，分光光度计测定总RNA的纯度，甲醛变性胶电泳质检总RNA的质量。取 50～100 μg总RNA用 miRNA Isolation Kit分离小于100 nt的小分子RNA，具体方法按说明书进行。
1.２.３ miRNA芯片杂交及数据分析 芯片由北京博奥生物芯片有限责任公司研制（晶芯?誖哺乳动物miRNA微阵列芯片服务V1.0芯片上一共有509个miRNA对应的探针）。miRNAs芯片杂交、扫描和数据分析均在该公司技术服务部完成，详细资料见网站（http://www.capitalbio.com）
1.2.4 生物信息学分析 应用互联网上miRNA靶基因预测软件（Pictar[9]、Targetscan[10]、MiRbase[11]、MiRanda[12]）在线服务站点，输出差异表达miRNA的预测靶基因，取至少3个软件预测到的基因作为靶基因。
1.2.5 荧光定量RT-PCR miRNA的RT PCR方法参照Chen等[13]的方法。相应的PCR引物见表1。采用U6 RNA作为内标，进行归一化。
1.2.6 Western Blot分析 分别取2例鼻咽癌原代细胞（NPC43，NPC44）和1例鼻咽正常上皮原代细胞（NPNE5）Trizol 提取RNA后的剩余液，按照Trizol试剂说明书提取蛋白，-80 ℃保存待用。鼠抗人SPARC 单克隆抗体；兔抗人CCNG1多克隆抗体均购自DAKO公司。
2 结 果
2.1 总RNA提取及质量鉴定结果
样品总RNA的OD260 /OD280之值在1.8～2.0之间。甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，条带清晰，28 S比18 S RNA条带亮度接近2 ∶ 1，RNA完好无降解，质量符合miRNAs芯片的质量要求(图1)。经miRNA Isolation Kit分离，分别获得C666、 5例鼻咽癌原代细胞（NPC8、NPC31、NPC43、NPC44和NPC47）及5例正常鼻咽上皮原代细胞（NPNE5、NPNE7、NPNE10、NPNE12和NPNE13）的小分子RNA。
2.2 鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞差异表达miRNA
分别将NPNE7和NPNE10，NPNE5、NPNE12和 NPNE13样本小RNA混合后与芯片杂交，NPC8、NPC31、NPC43、NPC44和NPC47样本小RNA分别与芯片杂交。杂交芯片经过扫描和数据整理后应用Cluster和SAM软件输出，得到miRNA表达谱和差异表达miRNA（表2）。应用非监督等级聚类（unsupervised hierarchical clustering）的方法将原代培养的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞的miRNA放到一起聚类，得到原代培养的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞miRNA表达谱（图2）。结果显示在原代培养的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞中let-7家族、miR-29、miR-23、miR-24、miR-22和miR-221等高表达。应用SAM软件two class unpaired的方法筛选出24个鼻咽癌相关miRNAs，包括18个在鼻咽癌表达下调的miRNAs和6个在鼻咽癌表达上调的miRNAs。其中在鼻咽癌表达下调 2倍以上的有：miR-203、miR-503、miR-424、miR-141和miR-148a共5个。在鼻咽癌表达上调 2倍以上的有：miR-25、miR-195和miR-15a共3个。
2.3 差异表达miRNA的RT-PCR验证结果
采用荧光定量RT-PCR的方法检测了芯片中显示表达下调的miR-203在几个原代培养的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞中的表达，同时对表达上调的miR-195，miR-25，miR-15a在NPC47的表达进行了检测，并采用U6进行归一化。miRNAs定量PCR扩增曲线和溶解曲线(图3)，显示溶解曲线呈单峰，引物的特异性较好。我们又将芯片结果与荧光定量RT-PCR结果进行比较(图4)，结果显示在NPC31、43、44、47中miR-203表达下调；在NPC47中miR-195，miR-25，miR-15a表达上调，miRNA芯片与定量RT PCR的结果一致，说明本研究芯片结果真实可靠。
2.4 miR-203靶基因预测结果
选择鼻咽癌下调的miR-203进行靶基因的预测。通过四个靶点预测软件（pictar，targetscan，miRanda，miRBase）预测miR-203可能的靶基因。为了减少假阳性率，我们只挑选至少出现在3个软件中的基因作为其可能的靶基因，共筛选出46个基因。我们将先前预测的靶基因与全基因组差异基因表达谱相比较发现，在这46个预测的靶基因中，有5个基因表现为上调表达，它们是：SPARC，CCNG1，ID2，INSIG1和CITED2，有3个基因表现为下调表达，其余基因无明显变化或者无数据。
2.5 Western blot检测预测靶基因的表达
在原代培养的鼻咽癌细胞中下调表达的miR-203，其预测两个的靶基因是CCNG和SPARC。它们在原代培养的鼻咽癌全基因组表达谱芯片中表达都上调，进一步利用Western blot技术检测原代培养的鼻咽癌细胞中CCNG和SPARC的表达，结果显示在原代培养的鼻咽癌中CCNG1和SPARC蛋白高表达(图5)，提示在鼻咽癌中miR203可能调控一系列基因表达包括CCNG1和SPARC基因。
3 讨 论
近年来，miRNAs作为生物体重要的基因调控分子，与疾病的关系尤其是与肿瘤的关系备受关注。随着miRNA芯片技术的，现已明确在多种肿瘤中存在miRNAs的异常表达或缺失，推断miRNAs很可能是一类新的癌基因或抑癌基因。有研究者运用miRNAs芯片对慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)的研究发现 2个miRNAs的基因，即mir-15a和mir-16，位于13q14染色体缺失区域，50%～60%的CLL的患者存在mir-16和/或mir-15a的表达下调[4]，miR-143和miR-145在结肠癌中表达下调[5]，Let-7在肺癌细胞中表达下调，在A549肺腺癌细胞中转染并表达Let-7，导致肿瘤细胞生长抑制[14]，这些均提示miRNAs已经成为研究肿瘤发生发展机制的一个新领域。
目前miRNAs在鼻咽癌中的研究尚未见报道，我们以miRNAs芯片为平台初步研究了鼻咽癌miRNAs表达谱，发现在原代培养的鼻咽癌细胞与正常鼻咽上皮细胞的之间存在24个差异表达miRNAs，其中18个miRNA在鼻咽癌中表达下调，6个miRNA在鼻咽癌表达上调。在鼻咽癌表达下调 2倍以上的有：miR-203、miR-503、miR-424、miR-141和miR-148a共5个；在鼻咽癌表达上调 2倍以上的有：miR-25、miR-195和miR-15a共3个。Irio等[15]用基因芯片研究了乳腺癌的miRNA，共发现了29个明显的差异表达的miRNA，其中miR-10b, miR125b，miR-145是下调的，而miR-21, miR-155是上调的，推测他们可能分别做为肿瘤的抑癌基因和原癌基因。
结合生物信息学的方法，使miRNA功能的研究更简单，而且有可能开辟一条新的研究路线，逐一找到miRNA的靶基因并揭示他们的功能。研究人员设计了多种机软件，对miRNA靶基因预测具有较高的准确性，应用Pictar， tangetscan， miRanda，mirBase等miRNA预测软件，对前面实验得出的鼻咽癌细胞下调表达的miR-203的靶基因进行检索和研究。我们选取至少在三个软件中出现的基因作为miR-203的靶基因，发现其靶点非常广泛，涉及到癌基因，细胞周期调控，细胞分化，转录调控，信号转导通路基因等46个潜在可能的靶基因。结合本组鼻咽癌细胞人类全基因表达谱结果（未发表资料），其中有5个基因为上调表达，它们是：SPARC，CCNG1，ID2，INSIG1和CITED2，有3个基因表现为下调表达，其余基因无明显变化或者无数据。在表达上调的5个靶基因中，我们挑选SPARC和CCNG1来进行蛋白水平的验证，结果表明相对于正常鼻咽上皮细胞，SPARC和CCNG1在鼻咽癌细胞中是高表达的，由此我们认为SPARC和CCNG1可能是miR-203的靶基因之一。较早期时研究者认为miRNA是与靶mRNA形成不完全互补双链来阻遏翻译。然而Wu等[3]的研究则表明其调节基因表达机制不尽如此。他们认为miRNA除了阻遏翻译外，还可引起mRNA快速脱腺苷酸化而被降解以抑制基因表达。这种对miRNA的研究在理论上丰富了我们对miRNA基因调控的认识。Cyclin G1参与DNA损伤后检查点调控、DNA修复和凋亡，细胞增生，并且在很多细胞增生活跃的组织/病变中都可以看到Cyclin G1的过度表达。Cyclin G1可以和GAK，CDK5，pRb相互作用参与多种凋亡通路。分泌性富含半胱氨酸的酸性蛋白(secreted protien acidic and rich in cysteine, SPARC)又称作骨连接蛋白(osteonectin)，编码基因位于染色体5q31-33。SPARC作为一种调节细胞外基质的糖蛋白，又是抗粘附蛋白，与某些基质成份、生长因子和细胞因子作用，参与组织重建、形态生成、细胞迁移和增殖，调节机体的生理和病理过程。近来发现SPARC在多种肿瘤中表达异常，尤其是有证据表明SPARC异常表达与肿瘤的侵袭和转移关系密切，抑制肿瘤细胞SPARC的表达，不但可以减少体外黑色素瘤肿瘤细胞的侵袭和粘附能力，而且还可完全遏制其致瘤能力。近年来，SPARC在肿瘤内皮的表达被确定，被论证为与MMP-2和肿瘤生长因子-β相似的调节血管生成的相关基因。
综上所述，本研究首次以miRNAs芯片技术，对鼻咽癌miRNAs表达谱进行研究，发现鼻咽癌细胞存在一系列上调和下调的miRNAs；定量RT PCR验证结果表明该miRNA芯片技术可靠。专业靶点预测软件预测鼻咽癌下调表达miR-203的靶基因，发现其靶点非常广泛，涉及到癌基因，细胞分化，转录调控，信号转导通路等。将miRNA芯片，靶点预测结果以及基因表达谱芯片结果综合分析，推断SPARC和CCNG1可能是miR-203的靶基因，为进一步研究miR-203在鼻咽癌发生发展过程中的功能奠定了基础。
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