深低温反复冻融杀伤人眼脉络膜黑色素瘤OCM-1细胞的机制
作者：刘 斌， 李永平， 张波， 张文忻， 彭展
【摘要】 【目的】 研究-70 ℃反复冻融体外杀伤人眼脉络膜黑色素瘤细胞系OCM-1的机制。【方法】 OCM-1细胞反复冻融后,用噻唑蓝比色法及克隆形成实验检测细胞的杀伤情况和细胞生长活力，免疫组织化学方法检测细胞P16表达的变化，电镜及共聚焦显微镜观察冻融后细胞凋亡和坏死的形态学改变，并测定细胞的凋亡比率，流式细胞仪检测冻融前后细胞CD40表达比率及细胞膜电位的变化。【结果】 噻唑蓝比色法检测及克隆形成实验显示，冻融可以直接杀伤OCM-1细胞，且残存的细胞生长能力也明显受抑制。免疫细胞化学染色见对照组的细胞呈P16阳性，而冻融后的细胞均呈阴性，冻融后培养的细胞部分呈阳性。电镜下观察到冰晶的结构特征及细胞的坏死和凋亡等变化。激光共聚焦显微镜观察发现凋亡细胞随着冻融次数的增加而增多。流式细胞仪测定显示冻融后细胞膜电位下降, 冻融前后CD40阳性细胞比率差异明显，且呈一定的量效关系。【结论】冻融不仅可以明显杀伤OCM-1瘤细胞，还能抑制残存瘤细胞生长。反复冻融能诱导大量的肿瘤细胞发生凋亡, 此为杀伤肿瘤及诱导肿瘤退变的直接原因，其机制与线粒体膜电位及P16表达下调有关。冻融后瘤细胞坏死因子CD40表达增强，可能是增强机体的免疫应答，介导机体免疫杀伤瘤细胞的机理。
【关键词】 反复冻融； 脉络膜黑色素瘤； 细胞凋亡； CD40; 线粒体膜电位
Abstract：【Objective】 To investigate the mechanism of repeating -70 ℃ freeze thawing on human choroidal melanoma cell line OCM-1. 【Methods】 OCM-1 cells were frozen by repeating -70 ℃ freeze thawing for various frequency, then the death rate of cells were examined by MTT essay. The cell viability was measured by clone essay. The morphological changes of the cells were observed using electron microscope and the P16 immunocytochemistry staining was performed. The cell apoptosis rate of the OCM-1 cells was examined by laser-scanning confocal microscopy (LSCM). The cell CD40 positive rates and mitochondrial membrane potential (MMP) were observed by flow cytometry (FCM).【Results】 Growth of OCM-1 cells was inhibited by repeating -70 ℃ freeze thawing. And that showed freeze frequency dependent effects (P< 0.01). Different morphology of cells after -70 ℃ freeze thawing could be seen by electron microscopy. The classic morphologic characteristics of ice crystal and apoptosis were shown. The P16 immunocytochemistry staining showed positive reaction in the control group and negative reaction in the group of repeating -70 ℃ freeze thawing, then the positive reaction appearance in the cultured cells. Different cell apoptosis rates of the OCM-1 cells were showed by LSCM. Flow cytometry showed a positive correlation between the cell CD40 positive rates and lethal effect, but showed a inverse correlation the inverse correlation between the MMP and the cell apoptosis rate. 【Conclusion】 Freeze thawing can kill OCM-1 cells and also inhibits the growth of survivals. Repeating -70 ℃ freeze thawing induces a good deal of tumor cells to apoptosis, which is the immediate cause of tumor regression. The mechanism of this effect is that repeating -70 ℃ freeze thawing decreases the level of MMP and the expressed of P16. Freeze thawing induces the expressed of CD40, which may enhance immune response to kill tumor cells.
Key words: repeat freeze thawing; choroidal melanoma; apoptosis; morphology; CD40; mitochondrial membrane potential
近年来,冷冻技术因其治疗范围广、安全有效及微创等特点,在恶性肿瘤治疗中显示了令人鼓舞的应用价值[1,2]，已经成功地用于前列腺癌、气管内肿瘤、肝癌等治疗[3-5]。冷冻在一些恶性肿瘤的早中期治疗效果明显，并能有效治愈恶性肿瘤［６］。即便肿瘤到晚期甚至转移，当药物等常规治疗的手段效果非常有限时，冷冻治疗也能显示良好的效果［７］。临床治疗上，无限制的延长冷冻治疗的时间并不现实，时间越长对正常组织造成的损害也越严重，因此，冷冻治疗肿瘤采用的方法是快速冷冻、缓慢复温、反复多次冻融[8]。虽然冷冻治疗在临床上已广泛应用，但是反复多次冻融杀伤肿瘤细胞的机制并不十分清楚，研究其机制有助于我们在攻克肿瘤的治疗上取得进展。本实验针对冻融杀伤肿瘤细胞的机制进行研究，结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 试 剂
DMEM/F12(1∶1)培养基,胎牛血清（fetal calf serum FCS,）均购自Gibco公司。小鼠抗人P16，CD40单克隆抗体分别购于福州迈新公司和Chemicon公司。荧光染料Rhodamine 123为Sigma公司产品。FITC羊抗鼠IgG荧光二抗、Hoechst 33342染色剂均购自Dako公司。 仪器：美国ThermoForma生产-86 ℃超低温冰箱，型号:725。日本日立公司H-600型透射电镜。激光共聚焦荧光显微镜为德国Zeiss, LSM 510 Meta型。美国BD公司FACSAria型流式细胞仪和BD FACSiva software数据分析软件。
1.2 实验分组
调节细胞浓度为1×106/mL，取1 mL置入EP管，PBS洗涤，离心弃上清，置入超低温冰箱，调节温度为-70 ℃，每次冻融时间均为0.5 min，共分为1、2、3、5次共4组。细胞从冰箱中取出后均放于37 ℃水浴恒温器中，复温2 min，再行下一次冻融。
1.3 噻唑蓝比色法检测
将细胞按上述冻融方法分别处理后，调节细胞浓度为1 × 105/mL，取80 μL加入96孔板中，加入培养液至180 μL，再加入( 3, 24, 5 dimethyliazol 22, 5 diphenyl tetrazolium bromide)MTT液20 μL, 每一处理条件设6个重复孔，并设阴性对照组及空白对照组。继续培养4 h后,弃去上清液,每孔加入二甲基亚砜（DMSO）200 μL,充分混匀,在酶联免疫检测仪上测定每孔的吸光度(A 值),波长为492 nm。细胞杀伤比率。
1.4 克隆（集落）形成实验
分别取对照组，冻融1、2、3、5次组的细胞，用台盼蓝染色方法记数500个活力好的细胞接种于100 mm培养皿中，并使细胞分散均匀,每组均用3个培养皿，置37 ℃、5%CO2培养箱静止培养14 d后，甲醇固定，苏木素染色。记数细胞数 >50为一个克隆，计算克隆形成率。
1.5 免疫细胞化学染色
细胞经冻融处理后，收集细胞，PBS洗涤，吹散，用微量加样枪滴片，风干，甲醇固定。3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10 min，加血清并水浴10 min，加入一抗P16后，依次加入二抗，S-P/HRP复合物，上述步骤均以PBS缓冲液稍洗3次，DAB显色，Maye′s 苏木素复染细胞核，常规脱水、透明、封片。显微镜下观察。
1.6 透射电镜观察
细胞冻融处理后,收集细胞(细胞数量≥1 × 107 个/mL) 。加入PBS, 1 000 r /min离心10 min（r=12 cm）,弃上清。放入预冷的2%多聚甲醛2戊二醛前固定液( pH 值为7.3 ) 中,4 ℃固定2 h, 再次离心后弃上清。制作电镜切片，在透射电镜下观察及拍照。
1.7 激光共聚焦显微镜观察
细胞经冻融处理后，收集细胞，PBS洗涤，吹散，用微量加样枪滴片，风干，甲醇固定。水洗3 min，用Hoechst 33342染色5 min，晾干，甘油封片。共聚焦显微镜下观察。
1.8 流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的改变
细胞冻融处理后,收集细胞(细胞数量≥1 × 106)。洗涤2次,加入荧光染料Rhodamine 123至终浓度5 μmol/L, 于37 ℃、5%CO2 培养箱中负载细胞30 min后，再次洗涤2次,在流式细胞仪下,待荧光强度稳定后，每隔30 s计数10 000个细胞，连续5次。荧光强度高低代表细胞线粒体膜电位大小。
1.9 流式细胞仪测定CD40比率
细胞按上述方法冷冻后，收集细胞(细胞数量≥1 × 106)，每管加入100 μL含15%多聚甲醛的PBS，4 ℃固定15 min,离心,弃固定液。加入含10%FCS的PBS 4 ℃封闭2 h，洗涤3次后,每管加入5 ?滋g/mL的CD40单抗各100 ?滋L, 4 ℃孵育1 h，再次洗涤3次，于每孔中加入1 ∶ 1 000稀释的FITC羊抗鼠IgG 作为荧光二抗，4 ℃作用0.5 h后取出，充分洗涤3次后，并设空白对照管，使用流式细胞仪检测，并分析数据。
1.10 统计学分析方法
实验的数据均使用ｘ±ｓ表示，SPSS 12.0软件对数据进行统计学分析。
2 结 果
2.1 细胞的杀伤比率
随着冻融次数增多，杀伤比率明显增加（表1）。
2.2 克隆形成实验结果
对照组细胞克隆形成较为均匀,克隆率为27.3% ± 1.5%。冻融后，细胞的贴壁能力及生长能力明显减弱。克隆形成较小，数目较少,并随着冻融次数的增加克隆形成的量进一步下降（表1）。
2.3 免疫细胞化学染色结果
对照组细胞P16阳性（图1A），而冷冻后的细胞均呈阴性（图1B），冷冻后培养的细胞部分呈阳性（图1C）。
2.4 电镜观察结果
对照组结构完整，细胞为不规则圆形或多角形，胞浆丰富，胞质均匀，胞质内有丰富的线粒体、粗面内质网、核糖体、高尔基器、溶酶体和微丝;核膜清晰,核大，核仁明显，能见到核分裂。冻融后的细胞内发现梭形，边界清晰，低密度的裂隙，为早期冰晶的超微结构（图2A）。镜下见大量不同时期的凋亡细胞及典型的凋亡小体(图2B)。坏死的细胞密度降低，细胞膜破裂，消失，细胞成分外溢，染色质、胞质均溶解；有的细胞仅余核仁和完整的核膜，其他细胞成分均消失。
2.5 共聚焦显微镜观察细胞形态变化
对照组细胞Hoechst 33342染色见细胞核蓝色，规则圆形，大小均一(图3A)。冻融处理的细胞，镜下可见凋亡细胞的细胞核固缩而被Hoechst 33342染成亮蓝白色。不同冻融次数出现的凋亡细胞比率差异明显（表1）。0.5×3组出现凋亡细胞为最多（图3B）。坏死的细胞，细胞膜消失，细胞内容物逸出，核内容物脱出呈带尾的丝状或礼花状（图3C）。凋亡细胞随着冻融次数的增加而增多，达到一定程度后随着坏死细胞的增加反而减少。
2.6 流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的改变
冻融作用后,OCM-1细胞线粒体的膜电位下降,增加冻融次数,下降程度更加明显(表1)。
2.7 流式细胞仪测定细胞CD40的阳性比率
对照组的OCM-1细胞也有2.6% ± 0.3%的细胞表达CD40,随冻融次数增加，CD40表达率上升(表1)。
3 讨 论
3.1 冷冻后，细胞内冰晶形成杀伤肿瘤
Gage等[9]认为细胞内冰晶形成和冰晶的机械损伤是最重要的机制:细胞外液凝固结晶使细胞处于相对的高渗状态，致使细胞脱水和皱缩，而细胞外间隙形成的高渗状态使得冰晶容易通过细胞膜的微孔进入细胞，促使细胞内冰晶的形成，细胞膜的完整性被破坏。最后细胞内高度浓缩的电解质破坏细胞使之坏死、溶解。但是，此前的研究并没有发现冰晶的超微结构特征。本研究在电镜下发现早期冰晶形成的结构特征,直接证明了冻融通过形成细胞内冰晶杀伤肿瘤细胞，细胞外冰晶形成可以使细胞脱水、皱缩；而细胞内冰晶的形成则使细胞坏死、死亡。
3.2 反复冻融诱发OCM-1细胞发生凋亡及其机制
我们在临床上通过对视网膜母细胞瘤的冷冻治疗，发现冷冻灶没有明显的炎症反应，但是肿瘤最后呈退变型疤痕愈合。这说明冰晶损伤只是早期急性杀伤反应，冷冻应该还通过其他更加重要的机理杀伤肿瘤。Baust等[8]提出诱导大量肿瘤细胞的凋亡是冷冻杀伤肿瘤的另一个重要机制，可能与细胞膜磷脂外翻，激活半胱天冬酶，DNA非随机性断裂等作用有关。ZARO等[10]认为P16是细胞周期调节蛋白之一，其作用是与细胞周期素D竞争性结合CDK4/6,阻止细胞从G1期至S期的进程，从而对有丝分裂进行负反馈调节。在肿瘤细胞中由于基因的突变或缺失，往往导致P16表达的增加。在研究细胞凋亡机制的实验中发现，线粒体膜电位下降,可使细胞的通透性增加，释放细胞色素C,前体半胱天冬酶分裂，引起细胞骨架蛋白降解、核膜破裂、DNA降解等一系列损伤改变[11，12]。当这种损伤改变超过细胞自身的修复能力时,细胞将死亡(凋亡及坏死)。本实验发现，冻融后在共聚焦显微镜下能见到核固缩而被Hoechst 33342染成典型呈亮蓝白色的凋亡细胞，电镜下也可见到较多的凋亡细胞；凋亡细胞的比率随着冻次数的增加而增高，证实了反复冻融可以诱发大量的肿瘤细胞凋亡，我们认为多次冻融诱导肿瘤细胞发生凋亡，为杀伤肿瘤及诱导肿瘤退变更为重要的机理。对照组的细胞P16免疫组织化学染色呈阳性,冻融后的细胞则呈阴性反应；流式细胞仪检测发现瘤细胞线粒体膜电位下降,且变化的幅度与凋亡细胞比率的变化幅度相符，这些均提示冻融对肿瘤细胞的杀伤还存在着后续作用,细胞的增殖能力被明显抑制，无限恶性增殖的趋势暂时停滞，为抑制残存细胞的增殖生长的机制之一。而线粒体膜电位的下降，P16表达的下调是冻融诱发细胞凋亡的关键环节。
3.3 冷冻治疗可能能够活化CD40配体，介导机体免疫杀伤
有研究[13]发现冻融后可激发机体的细胞免疫应答对肿瘤细胞产生杀伤作用。也有报道冻融后肿瘤细胞可以释放抗原从而致敏树突细胞（dendritic cell, DC)激活免疫应答[14]。但是，冻融通过何种机制激发机体免疫应答还不确切。为了进一步研究冷冻治疗后增强免疫应答的机制，我们作了细胞CD40表达的流式细胞仪检测。CD40分子是肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族的成员之一，可以表达于不同分化阶段的B淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞等细胞上，它通过与活化T细胞上CD40配体相互作用，不仅可以作用于B细胞和调节机体体液免疫应答，而且可以增加T细胞、树突状细胞、巨噬细胞等细胞的免疫功能，诱导细胞因子的产生，从而影响机体细胞免疫反应[15]。CD40分子激发后的树突状细胞可以不需CD4+ 细胞的辅助，直接活化CD8+细胞毒性T细胞（CTL）[16，17]。实验中发现随着冻融次数的增加，瘤细胞CD40的表达增强，并呈一定的量效关系，提示冻融通过上调细胞CD40的表达，活化CD40配体，可能是增强机体的免疫应答，介导机体免疫杀伤瘤细胞的机理。
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