Prader-Willi综合征分子分型诊断方法的初步研究
作者：李洪义， 李海飞 孟舒， 邹小兵， 郑辉， 陈争， 段红蕾
【摘要】 【目的】 探讨Prader-Willi综合征（PWS）的短串联重复序列（STR）连锁分析诊断方法，为遗传咨询提供相关信息。【方法】 对一例临床疑似病例经甲基化特异性PCR（MS-PCR）确诊为PWS后，应用15号染色体特定区域的STR进行家系连锁分析，探讨其在PWS分子缺陷类型诊断方面的可行性。【结果】 STR连锁分析结果显示该患者为父源缺失型PWS。【结论】 STR连锁分析是一种可准确诊断PWS并明确其分子缺陷类型的好方法；国人相关区域的STR位点及其多态信息等有待进一步研究，以完善并最终建立该方法。
【关键词】 Prader-Willi综合征； 短串联重复序列； 连锁分析； 基因组印迹
Abstract:【Objective】 The purpose of this research was to apply the molecular diagnostics to Chinese Prader-Willi Syndrome (PWS) patient, and finally provide genetic counseling to PWS families. 【Methods】 In addition to methylation-special PCR (MS-PCR), a new method of linkage analysis by six short tandem repeat(STR) was used to detect the molecular genetic defect of one Chinese PWS case. 【Result】 This patient could be diagnosed as PWS by Methylation-special PCR and STR linkage analysis. Also, the linkage analysis revealed that the patient had the paternal deletion of 15q11-q13. 【Conclusion】 This STR linkage analysis can identify the molecular defect of PWS cases quickly and accurately. With more STR loci analyzed and their polymorphism information content obtained, this linkage analysis method could be better developed and become a potential diagnostics in PWS cases.
Key words: Prader-Willi syndrome; sshort tandem repeat; linkage analysis; genomic imprinting
Prader-Willi综合征（PWS）是一种与基因组印迹相关的遗传性疾病，临床主要特征是新生儿期和婴儿期肌张力减退，吸吮困难；儿童期食欲过盛导致肥胖,身材矮小,促性腺激素分泌不足的性腺机能减退和发育延迟伴中度智力低下[1,2]。国外报道发病率约为每1万至2.2万人中一例[3]。基于DNA的分子诊断是确诊的惟一方法，在早期和症状不典型患者的诊断中具有重要作用。我们采用甲基化特异性PCR确诊了一例PWS患者，应用STR家系连锁分析方法对其进行了分子缺陷类型的研究，为建立PWS分子分型方法的研究奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 研究对象
患者，男，8岁，中山大学附属第三儿童行为发育研究中心门诊病人，临床怀疑为PWS患者。该患者足月顺产，新生儿期肌张力低下，哺乳困难需人工喂养；3岁起开始食欲过盛，随年龄增长而明显肥胖，就诊时身高1.25 m，体重48 kg，额径窄，杏仁眼，上唇薄，手足短小；中度智力低下，语言功能轻度障碍；外生殖器发育不良，双侧隐睾。患者父母表型正常。
1.2 甲基化特异性PCR（MS-PCR）
1.2.1 基因组DNA的亚硫酸氢钠预处理 取患者外周血常规提取基因组DNA，使用CpGenomeTM DNA Modification Kit（Chemicon) 甲基化处理，所获得的甲基化处理DNA置-20 ℃备用［4］。
1.2.2 聚合酶链反应 人类15q11-13区域内SNRPN基因启动子区含有CpG岛,该区域母源性等位基因处于甲基化状态，而父源性等位基因处于非甲基化状态，根据经亚硫酸氢钠修饰处理后此DNA序列的差异,可设计出针对父源和母源基因的引物。使用Prader-Willi/Angelman 甲基化诊断试剂盒(CpGenomeTM Prader-Willi/Angelman Amplification Kit, Chemicon)进行PCR扩增。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外光下观察DNA条带。
1.3 短串联重复序列（STR）连锁分析
结合国外PWS研究进展[5]和典型PWS缺失断裂点的位置，我们自行选择了15q11-13典型缺失区域内的D15S646、D15S817、D15S1513、D15S822和15q11-13区域外FBN1、FES等6个STR遗传标记进行连锁分析。自行设计STR扩增所需引物，由上海英骏生物公司合成。
1.3.1 聚合酶链反应 30 μL PCR总反应体系包含1×PCR缓冲液，2.5 mmol/L MgCl2，200 ?滋mol/L dNTP，1.5 u Taq酶(MBI)，STR上下游引物各0.17 μmol/L和DNA模板。应用Perkin-Elmer 公司的热循环扩增仪进行PCR扩增。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，紫外光下观察并记录扩增结果。
1.3.2 DNA序列测定 以STR扩增引物为测序引物，在ABI377测序仪上，对患者核心家庭3名成员各STR的PCR扩增产物进行测序，确定STR等位基因核心序列重复数目。
1.3.3 连锁分析 对患者及其父母的6个STR基因型进行分析，根据这些位点在核心家庭中的遗传关系，分析确定患儿的分子缺陷类型。
2 结 果
2.1 甲基化特异性PCR结果
本方法的基本原理：人类15q11-13区域内SNRPN基因启动子区含有Cp G岛,该区域上父源性等位基因处于甲基化，而母源性等位基因处于非甲基化状态，使用亚硫酸氢钠等化学试剂可将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,基于这种差异性, 正常人DNA则母源性特异M引物和父源性特异P引物两对引物均扩增,可见174 bp母源性PCR产物和100 bp父源性PCR产物。PWS 患者DNA仅母源性特异M引物扩增,因此，只见174 bp母源性PCR产物。
本例患者甲基化特异性PCR结果只显示174 bp母源性PCR产物，而未见100 bp父源性PCR产物，表明该患者为PWS。患者甲基化特异性PCR产物电泳图见图1。
2.2 短串联重复序列（STR）连锁分析结果
连锁分析结果显示，该PWS患者父源性15号染色体的15q11-13区域内的STR遗传标记（D15S646-D15817-D15S1513-D15S822）片段发生缺失(由于D15S822点位于典型缺失范围内，推测患者在该点亦为缺失)；在15q11-13区域外，STR遗传标记(FBN1-FES)的单倍型5-12来自父亲，而另一条正常15号染色体完全由母亲传递而来。患者核心家庭成员各STR基因型见表1，家庭STR基因型分析图见图2。
3 讨 论
PWS是一种与基因组印迹相关的遗传性疾病，现在已经明确的引起PWS的分子缺陷类型主要包括：（1）父源性15q11-13区域缺失，约占70％；（2）母源性15号染色体单亲二体，约占20％～25％；（3）印迹缺陷，约占2%～4%；（4）染色体平衡易位及其它罕见原因，小于1％[1,6]。故目前约有99％的PWS患者可以借助各种细胞与分子诊断方法进行确诊。
PWS主要的细胞与分子诊断方法中[7]：FISH和甲基化特异性PCR是目前国内外主要使用的诊断方法，FISH主要用于诊断缺失型或15q相关区带易位患者；MS-PCR可用于诊断缺失型、单亲二体（UPD）和印迹缺陷3种类型的患者，即可以对99％的PWS患者进行诊断，但是不能区分此3种类型。这两种方法结合，仍然不能区分单亲二体和印迹缺陷这两种类型，由于不同类型的PWS其再发风险有显著的差别，故仅用这两种方法相结合诊断PWS，无法为这两种类型患者及其家庭提供良好的遗传咨询和优生指导。
对于本例疑似PWS患者，在我们MSPCR进行检测确诊的基础上，自行选择了15q11-13典型缺失区域[8,9]内D15S646、D15S817、D15S1513、D15S822和15q11-13区域外FBN1以及FES共6个STR遗传标记进行STR连锁分析。根据本研究的患者连锁分析结果，可以得出结论：本例PWS患者是由新生（de novo）缺失突变引起的，这种缺失可能是由于15q11-q13的结构不稳定引起的。
上述结果显示，通过选取PWS典型缺失区域内外的STR进行家庭连锁分析，能具体区分缺失型和单亲二体型PWS患者（这两型占PWS总数的95％）。在STR的选择上，若仅选择典型缺失区域内的STR，则父源缺失型和母源性同源单亲二体型的基因型表现一致，无法进行区分，故我们选择了典型缺失区域内、外的STR。该方法亦可以区分同源和异源单亲二体。作为一种可行的确定PWS分子缺陷类型的方法，本文所用的6个STR虽然可以对该患者作出诊断，但仍然需要对典型缺失区域内、外众多的STR进行筛选，分析其多态信息量，从而挑选适合于人群的STR，并进一步完善这种连锁分析方法。
对于临床上怀疑为PWS的患者，可首先用甲基化特异性PCR进行检测确诊；而为了明确具体的PWS分子缺陷类型，继而可以应用STR家庭连锁分析法进行分析，此方法能准确可靠地检测和区分缺失型和单亲二体两类PWS患者，至此，引起PWS的主要3种类型，缺失型、单亲二体（UPD）和印迹缺陷的具体分子缺陷类型可以得到确定，这对于PWS的确诊、遗传咨询、产前诊断和优生工作都具有积极的作用。同时，由于PWS和AS（Angelman综合征）的遗传机制相似，大约70％的PWS及AS 是由15q11-13区域长约3～4 Mb的缺失引起的，如果这种缺失发生在来自父亲的15号染色体上，则表现为PWS；反之，如缺失发生在来自母亲的15号染色体上，则表现为AS。故该连锁分析方法也适用于缺失型和单亲二体型AS的诊断。
PWS 作为一种遗传综合征，尚缺乏有效的方法,而该病早期的表现不特异，如果婴儿时期出现无明显原因的肌张力低下和喂养困难，临床上应怀疑本病。遗传学诊断是该病确诊的依据，而具体的分型诊断，对于遗传咨询和产前诊断，具有重要意义。
【】
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