前列腺精子结合蛋白的二维凝胶电泳及质谱分析

【摘要】  【目的】 应用精子膜蛋白亲和层析柱分离金黄地鼠前列腺精子结合蛋白，并用二维电泳和质谱对金黄地鼠前列腺精子膜结合蛋白进行初步分析。【方法】 应用附睾精子膜亲和层析柱纯化前列腺精子结合蛋白,采用二维凝胶电泳对纯化的前列腺精子膜结合蛋白进行蛋白分离和图像分析，并结合基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析及数据库搜索从而鉴定部分蛋白质斑点; RT-PCR检测已鉴定蛋白在前列腺及未受精卵子中的mRNA的表达。 【结果】 附睾精子膜蛋白亲和层析柱可纯化出前列腺结合蛋白，前列腺附睾精子膜蛋白结合蛋白的二维凝胶电泳蛋白图谱。分离的蛋白质斑点为30个，质谱鉴定出2个蛋白点，一为热休克蛋白105，另一羰基还原酶（NADPH）-3。前列腺和未受精卵中均表达热休克蛋白105和羰基还原酶-3的mRNA。 【结论】 自前列腺分泌物中分离出精子膜结合蛋白，金黄地鼠前列腺中精子结合蛋白经双向电泳及飞行质谱分析鉴定出蛋白热休克蛋白和羰基还原酶。

【关键词】  前列腺分泌蛋白; 附睾精子膜蛋白; 二维凝胶电泳; 质谱

    Abstract: 【Objective】 The aims of this study was to identify and purify the ventral prostate secretory sperm binding proteins and analyze the ventral prostate sperm binding proteins by 2D- electrophoresis and MOTIF. 【Methods】 The ventral prostate secretory sperm binding proteins were identified and purified by epdidymal sperm membrane affinity chromatography.  The protein spots excised from 2D gels were digested with trypsin and then the resulting peptides were identified by using peptide mass fingerprinting feature by database searching. The mRNA of heat shock protein-105 and carbonyl reductase（NADPH）-3 were detected in ventral prostate gland and unfertilized oocyte by RT-PCR. 【Results】 It was purified sperm membrane proteins from ventral prostate secretory proteins. About 30 spots were separated by 2D-electrophoresis. Heat shock protein-105 and carbonyl reductase-3 are identified by MOTIF from ventral prostate sperm binding proteins. Both mRNA of heat shock protein-105 and carbonyl reductase （NADPH）-3 were expressed in ventral prostate glands and unfertilized oocyte.  【Conclusions】About 30 of ventral prostate secretory proteins bind to sperm. Heat shock protein-105 and carbonyl reductase （NADPH）-3 are identified from the ventral prostate secretory sperm binding proteins.

    Key words: ventral prostate secretory protein; epdidymal sperm membrane protein; 2D-electrophoresis; mass spectometry

      前列腺为雄性附属性腺之一，而精浆主要由雄性附属性腺分泌。精浆对精子生殖力的影响有许多矛盾报道；体外获得的牛附睾尾部的精子的生殖力低于射出的精子的生殖力，但在猪猫和大鼠则相反[1]。更多的证据表明精浆蛋白与生殖力相关。高生殖力的牛精浆中存在Mr为26 k的pI6.2和Mr为55 k的pI4.5蛋白,但低生殖力的牛精浆中存在另两种蛋白[2]。马、人精浆中也发现与生殖力相关蛋白[3]。雄性附属性腺对生殖力的影响目前主要来自啮齿类动物实验，去除雄性附属性腺，特别是前列腺和精囊腺可导致小鼠、大鼠的生殖力下降, 去除全部附属性腺或壶腹腺或前列腺可引起胚胎早期死亡[4]。体外实验显示前列腺或壶腹腺可影响修饰精子的膜蛋白和膜糖蛋白[5]。交配后精浆停留于子宫内，其中的大分子不能通过子宫进入输卵管内。鉴于精子仅在射精时与附属性腺分泌物接触,就此笔者认为雄性附属性腺蛋白可能与精子表面特异结合进而影响生殖力。精子表面存在附属性腺抗原和精浆来源物已有报道[6]，但缺乏对附属性腺每一腺体成员影响精子生殖力、精子膜的了解。既往研究证实腹前列腺和壶腹腺对生殖力有调节作用，进一步的研究表明仅腹前列腺起作用[4]。认识前列腺的影响生殖力的作用,首先应分离与精子作用的蛋白。本研究应用附睾精子膜蛋白亲和层析分离前列腺蛋白,应用二维电泳电泳和质谱对金黄地鼠前列腺精子膜结合蛋白进行初步分析。

    1   材料和方法

    1.1   材料及设备

    1.1.1   研究对象   金黄地鼠前列腺分泌物及附睾精子。

    1.1.2   试剂及设备   除非特别提及, 所有化学试剂均为分析纯并购自美国Sigma (USA) 公司。 胰酶(typsin)购自美国Promega公司。等电聚焦所用的固定pH梯度胶条(immobilized pH gradient strip, IPG strip)、再水化液、覆盖液、2-D Clean-Up试剂盒均为英国Amerchan公司产品。双向电泳在Ettan IPGphor Ⅱ IEF System 和Ettan DALT twelve Large Vertical system (英国Amerchan公司)的装置上进行。飞行质谱分析采用Voyager-DETM STR (PE Biosystems, USA)质谱仪分析。

    1.1.3   附睾精子膜蛋白制备   附睾精子收集, 4只健康14~20周龄雄鼠用致死量的4％戊巴比妥钠麻醉后，切开腹腔，暴露并游离附睾；用含5 mmol/L HEPES/0.264 mmol/L蔗糖缓冲液 [pH 7.4，含2 mmol/L苯甲基磺酰氟 (PMSF) 和 10 mmol/L 碘乙酰胺]的注射器21号磨平针头，经输精管逆行冲出精子。冲出精子经PBS (pH 7.4,含 2 mmol/L PMSF和10 mmol/L碘乙酰胺)洗3次 (每次在4 ℃条件下600 × g离心5 min)。重悬于0.5% NP-40蔗糖缓冲液中, 调整精子浓度为2×106/mL，置于冰上20 min。然后在0 ℃，10 000 × g下离心15 min，收集上清即为膜蛋白，经超滤膜浓缩后(Centricon-3，美国Amicon公司)定量蛋白。

    1.1.4   前列腺分泌物的收集   将6只14周龄金黄地鼠的前列腺(VPG)分离。 腺体表面切几个口，置自制不锈钢滤网上，离心收集分泌物于离心管内。收集的腺体分泌物置-20 ℃冰箱待用。

    1.2   鉴定和纯化前列腺分泌物中精子结合蛋白

    1.2.1   精子膜蛋白基质亲和层析柱纯化前列腺结合蛋白   附睾精子膜蛋白亲和柱的制备步骤略述如下,收集的附睾精子膜蛋白溶于磷酸盐缓冲液(pH 7.4)上DEAE-柱, 经含1 mol/L NaCl的磷酸缓冲液（PB，0.02 mol/L, pH 5.8）洗脱。收集的洗脱组分经饱和硫酸铵沉淀、过滤后用双蒸水透析后冻干即为金黄地鼠附睾精子膜蛋白（EPI）。 2 g活化CNBr-Sepharose4B凝胶经溶涨后,经400 mL 10-3 mol/L HCl淋洗15 min。 30 mg的EPI溶于10 mL交联溶液内并在室温下与凝胶混匀2 h。 凝胶中未结合的蛋白经600 × g 离心10 min去除。剩余的活化基团用1 mol/L甘氨酸封闭。 将制备好的EPI-CNBr-Sepharose4B凝胶装柱。柱洗3遍去除非特异吸收蛋白，每1遍顺序用含1 mol/L NaCl(0.1 mol/L乙酸盐缓冲液pH 4)和含1 mol/L NaCl(0.1 mol/L硼酸盐pH 8.0)缓冲液洗, EPI-Sepharose-4B亲和柱已制备待用。前列腺分泌物在2 000 × g离心30 min，收集上清用0.05 mol/L PB, pH 7.4调整蛋白为3 mg/mL。 前列腺蛋白上EPI-Sepharose4B柱, 含3 mol/L KSCN PB缓冲液洗脱特异结合蛋白。 洗脱的组分收集、透析、冻干、储存于-20 ℃。

    1.2.2   结合蛋白电泳分析  ①结合蛋白的非变性和变性SDS-PAGE电泳。8 ?滋g的前列腺精子结合蛋白上样于10%非变性凝胶(凝胶和缓冲液中无SDS) 和10% SDS-PAGE中电泳分析。考马斯亮蓝染色。②二维凝胶电泳分析。前列腺分泌物溶于裂解液(8 mol/L, Urea 40 g/L, CHAPS 40 mmol/L Tris)中, 经4 ℃低温超速离心12 000 × g 30 min后收集上清, 35 ?滋g样本上样电泳, 2-D标准品(Bio-Rad 公司, USA)同时在另一凝胶上电泳。凝胶经银染显色。 所有实验至少重复3次。凝胶斑点经扫描仪Image Scanner Ⅱ (Amersham, 英国)扫描, 图像贮存分析, 对应的斑点的等电点和分子量参照2-D标准品确定。③双向电泳分离的结合蛋白的胶上消化。参照SDS-PAGE电泳对应的分子量的结果在2D凝胶上的选取13个斑点。 手工将斑点切除置1.5 mL离心管内, 将3块凝胶的斑点置同一管内, 加入高纯度的胰酶消化并抽提蛋白。④飞行质谱分析。应用Voyager-DETM STR质谱仪在20 kV加速电压和 70%栅极电压下进行质谱分析, 肉桂酸[CHCA (alpha cyano-4-hydroxy cinnamic acid)]作为基质。新鲜配制10 mg/mL肉桂酸于乙腈溶剂(含0.1%三氟乙酸) 中。抽提的消化蛋白(或多肽)按1 ∶ 4比例与基质充分混合。将制备好的样本滴于不锈钢的样本台上, 空气干燥。⑤质谱数据的校准收集和数据库搜索。依照标准肽质谱值进行样本质谱值校准。各质谱峰值导入MS-FIT (http://prospector.ucsf.edu) 计数数据库进行匹配搜索。

    1.2.3   RT-PCR验证相应鉴定蛋白mRNA的表达

    雄性金黄地鼠过量麻醉处死, 游离14~20周龄的前列腺, 在雌鼠发情期分离卵巢和输卵管，冲出未受精卵, 用于mRNA的抽提取。RNA的提取与cDNA合成：分别取约50 mg干重前列腺组织或未受精卵用Trizol(invitrogen，美国)试剂盒提取总RNA。cDNA合成根据逆转录酶（Qiagene，德国）说明书操作。PCR扩增：含10×缓冲液2.5 ?滋L，MgCl2(25 mmol/L) 2.5 ?滋L，dNTP(1 ?滋L)，上下游引物（12.5 pmol/L）各1 ?滋L，Taq DNA聚合酶0.3 ?滋L（1 U），cDNA 1.5 ?滋L，补足ddH2O至总体积为25 ?滋L。在DNA循环合成仪（德国，Eppendorf）内扩增。采用热启动法，反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 1 min变性，53 ℃ 1 min退火，72 ℃ 1.5 min 延伸，共进行35个循环，72 ℃ 7 min 延伸。以?茁肌动蛋白作为内参照，引物序列从Genbank获褐家鼠热休克蛋白105（NP001011901）和羰基还原酶（LOC688320）序列, 获金黄地鼠?茁肌动蛋白（CAC38394），应用Primer primer5软件设计引物，具体如下。?茁肌动蛋白，上游：5′-GCTGTCCCTGTA TGCCTCT-3′，下游：5′-CTCGTTGCCAAT GGTGAT -3′，扩增产物343 bp。热休克蛋白，上游：5′-TATCCAGCAAGACAACAGT-3′，下游：5′-TCAGAAGGTCCCTCCCTA-3′，扩增产物245 bp；羰基还原酶，上游：5′-TATCAATGTAGGCAAAG AAGC-3′，下游：5′-CTGTAGGTGGTCAAGTT AGGA-3′，扩增产物483 bp；扩增产物经1%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统（美国，UVP）摄取图象并分析条带的光密度值，以?茁肌动蛋白的条带作为内参，获得相对光密度值。

    ２   结   果

    2.1   EPI-sepharose 4B 亲和柱分离前列腺分泌蛋白

    前列腺分泌蛋白结合洗脱组分紫外光吸收谱见图1, 峰Ⅰ为前列腺蛋白不与基质结合蛋白。 峰Ⅱ经含0.5 mol/L NaCl的0.01 mol/L PB, pH 7.4洗脱峰, 提示为非特异性与精子膜结合蛋白. 峰Ⅲ用含3 mol/L KSCN 的 0.01 mol/L PB, pH 7.4 缓冲液洗脱的峰, 这一组分为特异性与精子膜结合蛋白。

    2.2   前列腺精子结合蛋白的电泳分析

    2.2.1   前列腺精子结合蛋白非变性电泳及SDS-PAGE电泳分析   分离的前列腺精子膜结合组分的非变性电泳, 可见2条主带 (图2,泳道2)。 而10% SDS-PAGE电泳分析结果示, 9条蛋白电泳带, 分子量分别为75 ku, 53 ku, 44 ku, 30.5 ku, 27 ku, 24 ku, 17 ku和16.5 ku, 还有一分子量小于14.4 ku带(图3)。其中75 ku, 53 ku组分为主带。 27 ku带在前列腺分泌物中为次要带, 但经精子膜蛋白亲和柱层析后则成结合蛋白中的主带。