载雄激素受体三螺旋形成寡核苷酸ＰＥＧ-ＰＬＧＡ纳米粒子的制备与应用
【摘要】 以生物可降解材料聚乙二醇-聚乳酸聚乙醇酸共聚物（ＰＥＧ-ＰＬＧＡ）制备载雄激素受体三螺旋形成寡核苷酸的纳米粒子（ＴＦＯ-ＮＰｓ），并初步探讨其对前列腺癌ＬＮＣａＰ细胞的生长抑制作用。 【方法】 采用改良自乳化溶剂挥发法（ｍｏｄｉｆｉｅｄ-ＳＥＳＤ）制备ＴＦＯ-ＮＰｓ，对其形态、包封率、载药量及体外释放特点进行鉴定。倒置荧光显微镜观察ＬＮＣａＰ细胞对ＴＦＯ-ＮＰｓ的摄取情况，四唑盐（ＭＴＴ）法测定体外细胞毒作用。 【结果】 制备的ＴＦＯ-ＮＰｓ呈球形、大小均匀，平均粒径１２８ ｎｍ，平均包封率和载药量分别为７２．２８％和１．０２％，在体外具有缓释作用。ＬＮＣａＰ细胞对ＴＦＯ-ＮＰｓ的摄取率显著高于裸ＴＦＯ。ＴＦＯ-ＮＰｓ对ＬＮＣａＰ细胞的抑制作用明显强于裸ＴＦＯ（Ｐ ＜ ０．０５），抑制率分别为６１．２％ ± ６．５％和２０．７％ ± ３．１％。 【结论】 本法制备的ＴＦＯ-ＮＰｓ理化性质优良，在体外能够有效抑制ＬＮＣａＰ细胞的增殖。
【关键词】 聚乙二醇-聚乳酸聚乙醇酸共聚 改良自乳化溶剂挥发法 纳米粒 三螺旋形成寡聚核苷酸 前列腺癌
Ａｂｓｔｒａｃｔ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】 Ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ＴＦＯ ｌｏａｄｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ （ＴＦＯ-ＮＰｓ） ｗｉｔｈ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｍａｔｅｒｉａｌ ｐｏｌｙ （ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）-ｐｏｌｙ （ｌａｃｔｉｄｅ-ｃｏ-ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ） （ＰＥＧ-ＰＬＧＡ） ａｎｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ＬＮＣａＰ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． 【Ｍｅｔｈｏｄｓ】 ＴＦＯ-ＮＰｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｅｍｕｌｓｉｏｎ ｓｏｌｖｅｎｔ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ （ｍｏｄｉｆｉｅｄ-ＳＥＳＤ）． Ｔｈｅｎ ｔｈｅｉｒ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ， ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｒａｔｅ， ｄｒｕｇ ｌｏａｄｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ． Ｔｈｅ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ＴＦＯ-ＮＰｓ ｂｙ ＬＮＣａＰ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ａｎ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ， ａｎｄ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｏ ＬＮＣａＰ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＭＴＴ ａｓｓａｙ． 【Ｒｅｓｕｌｔｓ】 Ｔｈｅ ＴＦＯ-ＮＰｓ ｗｅｒｅ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ， ｕｎｉｆｏｒｍ， ｗｉｔｈ ｍｅａｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ １２８ ｎｍ． Ｔｈｅｉｒ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｌｏａｄｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ＴＦＯ-ＮＰｓ ｗｅｒｅ ７２．２８％ ａｎｄ １．０２％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｔｅｓｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｈｏｗｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ ｒａｔｅ ｏｆ ＴＦＯ-ＮＰｓ ｗａｓ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｎａｋｅｄ ＴＦＯ． Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ＬＮＣａＰ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ＴＦＯ-ＮＰｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｏｂｖｉｏｕｓ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｎａｋｅｄ ＴＦＯ（Ｐ ＜ ０．０５）， ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒａｔｅｓ ｗｅｒｅ ６１．２％ ± ６．５％ ａｎｄ ２０．７％ ± ３．１％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． 【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ】 Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＴＦＯ-ＮＰｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ-ＳＥＳＤ ｍｅｔｈｏｄ ａｒｅ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ． ＴＦＯ-ＮＰｓ ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ＬＮＣａＰ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＰＥＧ-ＰＬＧＡ； ｍｏｄｉｆｉｅｄ-ＳＥＳＤ； ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ； ｔｒｉｐｌｅｘ-ｆｏｒｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ； ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ
纳米药物载体的构建是抗肿瘤研究中的一个热点［１，２］。作为基因药物载体，纳米粒子具有生物安全性好、稳定性强、转染效率高、作用时间长等优点。聚乳酸－聚乙醇酸［ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ-ｃｏ-ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）， ＰＬＧＡ］是一种生物相容性好、可生物降解的聚酯类高分子，它在体内降解成乳酸和羟基乙酸，最终代谢成水和二氧化碳，无毒性、无免疫原性，已被美国ＦＤＡ批准应用于临床研究 ［３］。雄激素受体三螺旋形成寡核苷酸（ｔｒｉｐｌｅｘ-ｆｏｒｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ， ＴＦＯ）是由本课题组自主设计的一段寡核苷酸序列，能有效抑制雄激素受体表达和前列腺癌细胞增殖［４］。为进一步增强ＴＦＯ的抗前列腺癌效果，我们以聚乙二醇［ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） ， ＰＥＧ］修饰的ＰＬＧＡ为材料，制备了载ＴＦＯ的ＰＥＧ-ＰＬＧＡ纳米粒子（后文简称ＴＦＯ-ＮＰｓ），并对其体外细胞毒作用作初步探讨，报告如下。
１ 材料和方法
１．１ 主要材料
聚乙二醇（甲氧基封端）修饰的聚乳酸-聚乙醇酸（ＰＥＧ-ＰＬＧＡ，山东罡正生物科技有限公司）、聚乙烯醇（ＰＶＡ，美国Ｓｉｇｍａ公司）、丙酮（广州化学试剂厂）、乙醇（广州化学试剂厂）、二氯甲烷（广州化学试剂厂）、四甲基偶氮唑蓝（ＭＴＴ，美国Ｓｉｇｍａ公司）。
１．２ 主要设备
ＦＮ２００４Ｎ分析天平（上海天平厂）、ＪＢ-２磁力搅拌机（上海雷磁新仪器厂）、ＴＧＬ-２０Ｍ冷冻离心机（湖南凯达仪器公司）、Ｖｉｒｔｉｓ ２Ｋ冷冻干燥机（美国Ｖｉｒｔｉｓ公司）、ＳＣＩＥＮＴＺ-ⅡＤ超声仪（宁波新芝生物科技股份公司）、ＺＦＱ-８５Ａ真空减压旋转蒸发仪（上海医械专机厂）、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ９０激光粒度测定仪（英国 Ｍａｌｖｅｒｎ公司）、Ｂｅｃｋｍｅｎ ｃｏｕｌｔｅｒ ＤＵ６４０分光光度计（美国 Ｂｅｃｋｍａｎ公司）、ＦＥＩ Ｑｕａｎｔａ ６００扫描电子显微镜（荷兰 ＦＥＩ公司）、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２０超滤离心管（德国 Ｓａｒｔｏｒｕｉｓ公司）、倒置荧光显微镜ＴＥ２０００-Ｕ（日本Ｎｉｋｏｎ公司）、全自动酶标仪ＥＬＸ８００（美国 ＢＩＯ-ＴＥＫ公司）。
１．３ 雄激素受体ＴＦＯ
ＴＦＯ序列［３］为５′-ＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧＡ-３′，由上海生工生物工程有限公司合成，相对分子质量４ ７６３，采用全硫代磷酸修饰。摄取实验中ＴＦＯ的５′端采用羧基荧光素（５-ＦＡＭ）进行荧光标记。
１．４ ＴＦＯ-ＮＰｓ的制备
采用ｍｏｄｉｆｉｅｄ-ＳＥＳＤ法［５］制备ＴＦＯ-ＮＰｓ。具体步骤如下：ＴＦＯ ２０ ＯＤ溶于２００ μＬ ＴＥ（ｐＨ ８．０）缓冲液中；３０ ｍｇ ＰＥＧ-ＰＬＧＡ溶于１∶１（ｖ／ｖ）丙酮／乙醇混合液中，形成有机相；将ＴＦＯ溶液加入有机相中，冰浴下超声乳化：５０ ｗ， ３ × １０ ｓ；磁力搅拌下（３００ ｒ／ｍｉｎ，ｒ＝１０ ｃｍ）将乳化液缓慢滴入３０ ｍＬ ３０ ｇ／Ｌ ＰＶＡ溶于中，形成纳米粒子悬液；将纳米粒子悬液移入真空旋转蒸发仪，４０ ℃减压蒸发１ ｈ，挥发除去残余的丙酮和乙醇。而后将ＮＰｓ悬浮分散液先于２ ０００ ｒ／ｍｉｎ低速离心除去团聚颗粒，再以１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ的速度离心４０ ｍｉｎ，沉淀用蒸馏水洗涤。离心和洗涤重复３次以去除ＰＶＡ及残余的丙酮和乙醇。所得纳米粒子１０ ｍＬ双蒸水重悬后冻干保存。
１．５ ＴＦＯ-ＮＰｓ的表征
取２ ｍＬ纳米粒子悬液样品，２５ ℃条件下动态激光光散射法（ＤＬＳ）测定纳米粒子大小、分布及ｚｅｔａ电位。取１ ～ ２滴纳米粒胶体分散体系，将其滴入覆有支持膜的铜网上，干燥后，粒子溅射镀金膜，在扫描电子显微镜（ＳＥＭ）下观察纳米粒子的形态、表面形貌。
１．６ ＴＦＯ-ＮＰｓ的包载率和载药量测定
将ＴＦＯ-ＮＰｓ制备过程中离心弃去的上清液收集起来，采用紫外分光光度法测定ＴＦＯ的含量（２６０ ｎｍ，１ ＯＤ ＯＤＮ≈３３ μｇ）。按如下公式包封率和载药量。包封率＝（投药量-游离药物量） ／投药量 × １００％；载药量＝（投药量-游离药物量）／纳米粒的质量 × １００％。
１．７ ＴＦＯ-ＮＰｓ体外释放实验
精确称量ＴＦＯ-ＮＰｓ ４０ ｍｇ，加入１０ ｍＬ ＴＥ缓冲液中，超声分散形成均匀纳米粒子悬液。将纳米粒子悬液放入超滤管中，在恒温振荡培养箱中保持３７ ℃、 １００ ｒ／ｍｉｎ振荡，每天定时取样（共２０ ｄ），并补充等量新鲜缓冲液于超滤管中，保持体积不变。更换出的滤液，用紫外分光光度计测定２６０ ｎｍ处吸光度，计算释放量，绘制累积释放曲线。
１．８ ＬＮＣａＰ细胞摄取实验
ＬＮＣａＰ细胞常规于含１００ ｍＬ／Ｌ胎牛血清的Ｆ１２培养液中，在３７ ℃、体积分数为５％ ＣＯ２、饱和湿度的细胞培养箱中传代培养。取对数生长期细胞，用含２．５ ｍｌ／Ｌ胰酶的消化液消化，以每孔１ × １０４个细胞种于６孔培养板，４８ ｈ细胞贴壁后吸除培养液，按分组情况分别加入无血清Ｆ１２稀释的ＴＦＯ-ＮＰｓ悬液（含ＴＦＯ ６ ｍｇ／Ｌ）和ＴＦＯ（６ ｍｇ／Ｌ），每组设３个平行孔，２ ｈ后吸除药物，ＰＢＳ洗涤３次，置于倒置荧光显微镜下观察。
１．９ ＭＴＴ法检测细胞增殖活性
取对数生长期细胞，消化后以每孔５ × １０３个细胞种于９６孔培养板，细胞贴壁后按分组情况分别加入Ｆ１２培养液（空白对照组）、ＴＦＯ（６ ｍｇ／Ｌ）、ＴＦＯ-ＮＰｓ（含ＴＦＯ ６ ｍｇ／Ｌ），每组设６个平行孔。２ ｈ后吸除药物，更换新鲜培养液继续培养７２ ｈ后，每孔加入ＭＴＴ ２０ μＬ（５ ｇ／Ｌ），继续培养４ ｈ，弃去液体，每孔加入１５０ μＬ二甲基亚砜，振荡混匀１０ ｍｉｎ，置于酶标仪上读取４９０ ｎｍ处吸光度（Ａ）值，抑制率：细胞抑制率＝ （１－实验组Ａ值）／对照组Ａ值 × １００％。
１．１０ 统计学方法
实验数据以均数±标准差表示，样本均数的比较采用ＳＰＳＳ １１．０统计软件进行 ｔ 检验。
２ 结 果
２．１ ＴＦＯ-ＮＰｓ的表征与性质鉴定
ＤＬＳ测定表明，ＴＦＯ-ＮＰｓ粒径分布呈较窄的单峰，且呈正态分布，多分散指数为（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｉｃｅｓ，ＰＤＩ） ０．２，平均粒径为１２８ ｎｍ，ｚｅｔａ电位为－３．７４ ｍＶ（图１）。ＳＥＭ照片显示ＴＦＯ-ＮＰｓ的形态为规则球形，表面光滑，大小均匀，纳米粒之间无黏连（图２）。ＴＦＯ-ＮＰｓ的包封率为７２．２８％ ± ３．０４％，载药量为１．０２％ ± ０．０６％ （ｎ ＝ ３）。体外释放实验显示，ＴＦＯ-ＮＰｓ的释放过程分为两个阶段，２４ ｈ内药物快速释放，释放量在３０％左右，２４ ｈ后药物进入持续性释放过程，２０ ｄ后累计释放量在９０％以上（图３）。
２．２ ＬＮＣａＰ细胞对ＴＦＯ-ＮＰｓ的摄取
加药后２ ｈ倒置荧光显微镜下观察ＬＮＣａＰ细胞对ＴＦＯ的摄取情况（激发波长：４８８ ｎｍ；发射波长：５２５ ｎｍ），可见ＬＮＣａＰ细胞摄取ＴＦＯ-ＮＰｓ 的比例明显高于裸ＴＦＯ，摄取ＴＦＯ-ＮＰｓ 的ＬＮＣａＰ细胞内荧光强度较高（图４）。
２．３ ＴＦＯ-ＮＰｓ对ＬＮＣａＰ细胞的体外抑制作用
ＭＴＴ法结果显示，ＴＦＯ-ＮＰｓ对ＬＮＣａＰ细胞的生长抑制率为６１．２％ ± ６．５％，裸ＴＦＯ对ＬＮＣａＰ细胞的生长抑制率为２０．７％ ± ３．１％，两者之间比较ｔ ＝ ３．２０５，Ｐ ＝ ０．０１，差异有统计学意义。
３ 讨 论
近年来ＰＬＧＡ纳米粒子药物载送系统已成为聚合物纳米粒子研究中的热点。由于ＰＬＧＡ纳米粒子具有疏水性的表面，进入血液循环后易被血清调理素吸附，由网状内皮系统（ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｙｓｔｅｍ， ＲＥＳ）清除，除靶向ＲＥＳ的药物外，很难有效载送药物到达其它靶组织。报道［６］采用ＰＥＧ修饰ＰＬＧＡ纳米粒子，能够使ＰＬＧＡ纳米粒子获得亲水性保护，可以有效避免ＲＥＳ的清除，延长循环时间，所以我们采用ＰＥＧ-ＰＬＧＡ材料制备载ＴＦＯ的纳米粒子。目前，制备ＰＬＧＡ纳米粒子最常用复乳溶剂挥发法，此法常以二氯甲烷为有机相，残留的二氯甲烷对机体的毒性较大，而本文采用ｍｏｄｉｆｉｅｄ-ＳＥＳＤ法制备ＰＥＧ-ＰＬＧＡ纳米粒子，以丙酮／乙醇做有机相，可以大大减低纳米粒子的毒性。
粒径大小、载药量和缓释能力是衡量纳米粒子优劣的重要指标。本法制备的ＴＦＯ-ＮＰｓ呈均匀球形，平均粒径１２８ ｎｍ，平均载药量为１．０２％，体外缓释作用可达２０ ｄ以上，与同类研究结果水平相当［７］，表明制备方法是成功的。文献报道ＰＬＧＡ纳米粒的载药量均较低［８］，如何提高聚酯类纳米粒子的载药能力是研究者共同面临的问题。我们正在探索通过适当提高聚合物的分子量、在外水相中用载药加以饱和等措施进一步提高ＰＥＧ-ＰＬＧＡ纳米粒子对ＴＦＯ的载药能力而又不显著增加纳米粒子粒径的方法。
由于ＴＦＯ是线性亲水性的核酸分子，而细胞膜是脂溶性脂质双分子膜，膜上又无核酸通道，因此裸ＴＦＯ较难透过细胞膜被ＬＮＣａＰ细胞摄取。经ＰＥＧ-ＰＬＧＡ纳米粒子包载后，ＬＮＣａＰ细胞对ＴＦＯ摄取率显著增加，这可能是由于通过胞吞作用聚合物纳米粒子可以有效地进入细胞［９，１０］，另外，由于纳米粒子具有特别小的尺寸、特别高的表面能，当纳米粒子具有适当的特性时可以直接穿透细胞膜进入细胞［１１］。正是由于ＰＥＧ-ＰＬＧＡ纳米粒子能高效地介导ＴＦＯ进入ＬＮＣａＰ细胞，因此ＴＦＯ-ＮＰｓ对ＬＮＣａＰ细胞的生长抑制作用明显强于裸ＴＦＯ。本文结果为以雄激素受体为靶点的前列腺癌分子靶向奠定了基础。
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