实时荧光定量PCR检测原发性肝癌中PRL-2基因的表达

               作者：程超， 郭爱林， 巫国勇， 谢春玲， 吴伟康 

【摘要】  【目的】 建立TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肝细胞再生磷酸酯酶2(PRL-2) mRNA表达水平，并应用该法检测原发性肝细胞癌中PRL-2基因的表达。【方法】 构建含PRL-2基因开放阅读框架的T载体，制作标准曲线。提取手术切除12例人肝癌、门静脉癌栓（PVTT）和癌旁组织总RNA 并逆转录为cDNA。应用实时荧光定量PCR法观察人肝细胞癌组织和门静脉癌栓及癌旁组织中PRL-2 的表达水平。【结果】 线性检测范围达5个数量级,最低检测下限为1×102 拷贝,最高检测上限为1×106 拷贝。PRL-2在所有的门脉癌栓及10例肝癌组织表达，仅在4例癌旁组织中表达。门脉癌栓PRL-2 mRNA表达水平显著高于肝癌及癌旁组织（P< 0.01），肝癌组织表达显著高于癌旁组织（P< 0.01）。【结论】 实时荧光定量PCR可以准确定量测定PRL-2基因的表达；PRL-2基因在门脉癌栓的更高表达提示其在肝细胞癌的发生、转移中可能起重要作用。

【关键词】  肝细胞癌； 聚合酶链反应; 基因表达； PRL-2基因

    Abstract：【Objective】 To quantitatively detect the mRNA expression level of PRL-2 in primary hepatocellular carcinoma with RT-PCR method. 【Methods】 T vector including open reading frame of PRL-2 gene was constructed to make standard curve. The total RNA isolated from human HCC, portal vein tumor thrombosis (PVTT) and adjacent liver tissue was reversely transcribed into cDNA. The RT-PCR method was used to analyze the expression level of PRL-2 gene. 【Results】 The RT-PCR method was performed successfully to precisely detect RNA level ranging from 1×102 copies to 1×106 copies. PRL-2 was expressed by all the portal vein tumor thrombosis (PVTT) and 10 cases HCC, but only by 4 cases paratumor tissue. The expression level of PRL- 2 gene was higher in PVTT than that in paratumor liver tissues and in HCC (P< 0.01), and it was higher in HCC than that in paratumor liver tissues. 【Conclusion】 The RT-PCR is the precise method to quantitatively detect PRL- 2 gene RNA level. The higher expression of PRL- 2 gene in PVTT suggesting that it may play an important role in the development and metastasis of the HCC.

    Key words: hepatocellular carcinoma; polymerase chain reaction; gene expression; PRL-2 Gene

    [J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28（６）:702-705]

     肝细胞再生磷酸酯酶 (phosphatase of regenerating liver, PRL)是一类新发现的小分子酪氨酸蛋白磷酸酯酶，由PRL-1、PRL-2和PRL-3三个成员组成[1]。它们具有酪氨酸蛋白磷酸酯酶共同活化序列HCXXGXXR，分子量约为20 ku，氨基酸同源性超过76％[2,3]。最近的研究表明，PRL-1、PRL-3与肿瘤的转移密切相关，特别是PRL-3与结肠癌、胃癌和黑色素瘤的远处转移存在密切相关性[4-8]。而PRL-2与肿瘤发生和转移的关系尚少见报道，为此我们建立了实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,QT-PCR）检测PRL-2基因的方法，并对PRL-2 mRNA在肝癌中的表达进行了研究。

    1 　 材料与方法

    1.1   肝癌组织

    12例新鲜肝癌、门静脉癌栓和癌旁肝脏组织来自2001年-2003年中山大学附属第一手术标本,手术切除组织立即液氮冻存。肿瘤组织均经病理检查证实,为肝细胞癌，根据TNM分期[9]均为Ⅳa期。

    1.2   试   剂

    Trizol Reagent、SuperScript Ⅱ逆转录试剂盒、DNaseⅠ购自美国Invitrogen 公司,PCR 试剂购自上海申能博彩生物公司,引物及荧光探针由上海博亚公司合成。ABI7000 荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。

    1.3   总RNA抽提及反转录

    取冻存组织100 mg ,加入Trizol Reagent 1 mL，匀浆后加入0.2 mL 氯仿,离心后吸取上清,加入0.5 mL异丙醇,离心沉淀后弃上清,70%乙醇洗沉淀，DNase I酶解可能残余的基因组DNA，RNA 溶于DEPC 水,甲醛变性凝胶电泳和以260 nm 及280 nm 吸光度值所获RNA 含量及纯度,分装后-80 ℃保存待用。反转录操作按Superscript Ⅱ(Invitrogen公司) 提供操作说明书进行,所得cDNA -20 ℃保存。

    1.4   PRL-2 T 载体的构建及标准品的制备

    PRL-2 引物设计: 5′端引物：ggatccact ATGGACCGTCCAGCCC，3′端引物：ctcgagCTACT GAACACAGCAATGCC,由上海生工公司合成引物。收集对数生长期的HepG2细胞,约 1×107,按照Trizol的说明提取RNA ,经紫外分光光度仪测定A260 nm定量，取1 ?滋g RNA为模板，采用one－step RT－PCR扩增特异性PRL-2片段(504 bp)。扩增产物用 10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳。鉴定条带的位置正确后, 切下目的条带, 参照柱式小量胶回收试剂盒中的操作说明, 回收、纯化，装入pMEM T easy 载体, 并经测序证明确实含有PRL-2 504 bp 片段。重组T 载体经碱裂解法抽提及PEG纯化后,以260 nm 吸光度测定含量,根据载体分子量计算其拷贝数, 以10 倍进行连续稀释, 得到拷贝数分别为1×106、1×105、1×104、1×103、1×102和1×101/?滋L的样品， 即可作为制备Q-PCR 标准曲线的标准品。

    1.5   引物与TaqMan探针

    引物和探针序列均由ABI Primer Express 2.0软件辅助设计。PRL-2引物 :上游5′－ACCAATGCTACTCTCAACAAGTTCA－3′;下游 5′－TGGCCAATCTAGAACGTGGATT-3′(131 bp);探针序列: 5′FAM－TAAGAAGTATGGAGTGACGACT－TAMRA 3′由上海基康公司合成。

    1.6   TaqMan Q－PCR

    PCR 体系总量25 μL∶ cDNA 2 μL, 10 ×Buffer 2.5 μL, 25 mmol/L MgCl2 1.5 μL, 10 mmol/L dNTP 0.5 μL, Taq 酶2.5 U , 100 mmol/L 引物及探针各0.1 μL，加双蒸水至25 μL。 PCR 条件为:94 ℃ 5 min 后,以92 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s 循环40 次。设定在每个循环的变性期结束后, 程序自动记录上一循环最后10% 时间的平均荧光值, 以表示在该循环结束时的PCR 产物的量。荧光种类选择FAM－490, 程序将按照设定的激发和发射光谱选择滤镜组, 分别为490 nm 和530 nm。反应完成后, 得到含所有标本的记录点曲线，选择PCR baseline subtracted (PCR 基线扣除) 模式进行数据分析和修正。在调整Baseline cycles ( 基线循环) 和计算Threshold value (域值) 后, 计算出Threshold cycle(Ct值)。Ct值和起始拷贝数有着对应关系, 可通过外标准曲线精确计算样品的起始拷贝数。

    1.7   数据处理

    ABI7000荧光定量PCR仪检测结果由ABI7000 Prism Software1.1系统进行分析,标本重复性及组间差异比较采用SPSS 10.0 进行统计。

    2   结   果

    2.1   标准曲线的建立及线性检测范围

    成功地建立了人PRL-2 cDNA 标准曲线（图略）,其线性范围可达5个数量级,最高检测上限为1×106 拷贝,最低检测下限为1×102 拷贝。标准曲线的直线回归相关系数r =-0.998 ,斜率为-3.52。

    2.2   灵敏度及特异性检测

    为了验证TaqMan 方法的特异性,我们将拷贝数分别为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×10的标准品经PCR 扩增和1.1 系统分析,产物进行3 %琼脂糖电泳(图1) 。电泳图显示,各泳道在130 bp 左右的位置均有特异性条带出现,并且荧光强度随起始模板数的递减有逐步降低的趋势。值得注意的是1×106 ～1×103之间的4个条带差别不明显。上述结果说明单靠普通的半定量PCR是无法准确预测初始拷贝数的。我们将特异性条带切下后,装入pGEM Teasy 载体,以M13 primers 进行测序,结果正确,从而保证了方法的特异性。本研究设定大于40 个循环仍无荧光信号明显增强为阴性标本。当以标准品进行10 倍连续稀释,发现最低可以检测1×102拷贝，最高可检测到5×106拷贝。将正常肝细胞系CL-1总RNA 作为模板,该样本PRL-2 mRNA 表达量均< 102 拷贝,检测结果阴性 ,故该方法的灵敏度约为100 拷贝。

    2.3   方法的重复性

    将5个不同稀释度的标准品(1×102～1×106拷贝)分6批次进行检测,以拷贝数得其批间变异(CV)分别为21.2% ,17.8% ,11.4%，26.5%,46.8% ;我们将上述5个标准品一式3 份检测,以拷贝数其批内CV 分别为32.1%，14.2%，10.7%，21.6%,40.3%。上述结果表明该方法的重复性好，特别是在浓度较低的情况下。

    2.4   PRL-2在肝癌、癌栓和癌旁组织中的表达

    Q-PCR技术检测发现12例肝癌患者门脉癌栓和10肝癌组织可检测到PRL-2 mRNA 表达，但是仅有4例癌旁组织可以检测到PRL-2 mRNA 表达。2例肝癌组织内未检测到PRL-2表达的患者，8例癌旁组织内亦未检测到PRL-2表达。其中门脉癌栓表达水平平均高于肝癌组织将近100倍（P< 0.01）; 肝癌组织比癌旁组织表达高出将近10倍（P< 0.01，表1）。PVTT和肝癌组织mRNA表达的相关系数为0.778。        

    3   讨   论

    3.1   RT-PCR技术的原理及其优越性

    多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR) 技术发明至今已近20 年了,在这期间其技术得到了不断的, 于1996 年推出的Q-PCR技术实现了PCR 从定性到定量的飞跃。Q-PCR 是一种用于定量测定起始模板拷贝数的新技术, 其原理为:在PCR 反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程, 荧光信号的强弱与靶基因的量即扩增产物的量成正比关系[10,11]，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该方法与常规PCR 相比, 具有特异性更强、有效解决PCR 污染和自动化程度高等特点, 目前已得到广泛应用。

    3.2   RT－PCR 方法定量测定PRL-2表达

    由于mRNA 用Q－PCR 方法进行定量时, 还需考虑到反转录效率以及mRNA 容易降解等问题, 因此我们通过T 载体克隆方案构建含PRL-2 基因的载体, 用所提取质粒DNA 作为实时荧光定量RT－PCR 的标准模板, 具有纯度高、来源广、易于保存、定量准确等优点,可长期用于检测。经过对质粒模板进行不同浓度梯度稀释, 检测扩增过程中荧光信号强弱来制备标准曲线,相关性好, 斜率达-3.52, 显示出随不同模板量而出现CT值良好的变化。在以往的PRL表达的研究中，大部分的工作采用了原位杂交、RT－PCR 和Northern blot 方法[6-8]，但是上述方法只能半定量分析,不能在mRNA 水平定量准确检测表达。而应用Q－PCR 技术可以对mRNA 水平进行实时定量分析。对12 例肝癌的PRL-2 基因的表达水平分析发现,肝癌中PRL-2 的表达水平普遍升高，而且所有PVTT的mRNA 水平是肝癌组织的800倍以上,肝癌组织表达水平是癌旁组织的8倍以上,说明PRL-2 作为在肿瘤发生发展中的重要分子可能发挥了特殊的作用。表达上调不但具有普遍性,而且具有极为明显的差异,提示可以用于癌肿复发或转移的预测和监视。

【】
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