肾移植术后受者体内微嵌合状态的研究

【摘要】  目的:探讨肾移植术后受者体内微嵌合状态与移植肾功能、排斥反应之间的关系。方法:采用对人类性别决定基因SRY扩增的巢式PCR方法， 对接受79例男性供肾的女性肾移植患者外周血的微嵌合进行检测分析。结果:总的微嵌合发生率为55.70% (44/79)，其中移植后6个月内微嵌合的发生率为35.71%，6～18个月内发生率为46.67%， 18个月以上发生率为71.43%。10例患者术后14 d至6个月连续观察发现微嵌合的出现呈波纹式动态变化。嵌合阳性患者的排斥反应发生次数明显少于嵌合阴性患者(P<0.05)，但二者血肌酐值差别无显著性(P>0.05)。结论:微嵌合阳性患者的排斥反应发生率明显降低。

【关键词】  肾移植 微嵌合 嵌合状态 移植物排斥

    Abstract:  Objective:To investigate the relationship among microchimerism, allograft function and the incidence of rejection after renal transplantation. Methods: Peripheral blood microchimerism was analyzed in 79 female recipients by means of nest PCR with primers from a sex determining region of Y chromosome. Results: Microchimerism was detected in 44 cases of 79 recipients (55.70%).The incidence of microchimerism was 35.71% in 0～6 month, 46.67% in 6～18 month and 71.43% beyond month 18, respectively. The occurrence of microchimerism in 10 recipients, periodically monitored from day 14 to month 6, dynamically fluctuated in waves. The incidence of rejection episodes in positive microchimerism recipients was lower than that in negtive ones(P<0.05), but no significant difference was found in any comparison of creatinine value (P>0.05). Conclusion: Peripheral blood microchimerism is frequently detected in recipient with long-term survival and associated with low incidence of rejection.

    Key words:  kidney transplantation; microchimerism

    微嵌合现象作为当前免疫抑制下器官移植出现的新特点已得到证实， 但有关微嵌合与免疫耐受状态间的关系看法不一。本研究旨在用对人类性别决定基因SRY扩增的巢式PCR方法，分析微嵌合的发生、，探讨它与移植肾功能、排斥反应及免疫耐受状态间的关系。

    1  材料和方法

    1.1  一般资料  2003年1月至2005年6月，79例接受男性供肾的女性肾移植患者作为研究对象，年龄19～69岁，平均（41.5±13.8）岁。其中71例有妊娠史，胰肾联合移植1例，肝肾移植1例，其供肾均为青年男性。病程在移植术后6个月以内者14例，6～18个月者30例，18个月以上者35例。

    1.2  标本采集  采集门诊随访女性患者外周血抗凝血2 ml，立即提取DNA，保存于-20 ℃。其中10例患者为连续观察，在术后第14天开始连续采集标本至第6个月。对所有患者采集标本的同时检测血肌酐值。

    1.3  外周血DNA提取  患者DNA提取采用盐析法（DNA Isolation Kit，Gentra公司生产）。取300μl全血加入0.98%的NH4Cl 1 ml破红细胞膜10 min，离心后取白细胞加入300μl细胞裂解液，充分混匀后放置10 min；加入蛋白质沉淀液150μl充分混匀,离心5 min(12000 r/min)；取上清液加入异丙醇300μl沉淀DNA；75%乙醇洗3次，待乙醇蒸发后加入溶解液100μl，-20 ℃保存。

    1.4  实验观察  根据人的性别决定基因SRY序列，设计引物对（S1：5'cagtaaaggccaacgtccagg 3'，S2：5'cgcattcatcgtgtggtctc 3'，A：5'tgttgtccagttgcacttcg 3'），引物由上海生工公司合成。患者DNA提取采用盐析法（DNA Isolation Kit，Gentra公司）。DNA经S1/A引物第一次扩增后，取2μl产物用S2/A进行第二次扩增。二次扩增产物经1%琼脂糖电泳，紫外线仪下观察记录结果。循环条件为：94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，总共25个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增仪选用PE-9600，总反应体系为20μl（PCR Core Systems，Promega）。

    1.5  统计学处理方法  不同组间微嵌合发生率比较用Fisher 精确概率法检验，微嵌合阳性与阴性患者肌酐值的比较采用t检验。

    2  结果

    2.1  SRY基因PCR扩增结果  正常男性DNA扩增产生290 bp Y染色体特异片段，而正常女性DNA扩增为阴性，接受男性供肾的女性受者DNA扩增产生阳性条带，即表明发生了嵌合(见图1)。本组79例患者检测结果显示：总的微嵌合发生率为55.70%(44/79)，其中6个月内微嵌合的发生率为35.71%（5/14），6～18个月内发生率为46.67%（14/30），18个月以上发生率为71.43%（25/35）。三组间比较，差别有显著性(P<0.05)。

    2.2  10例患者术后14 d至6个月连续观察结果  微嵌合的出现呈非均一性，以波纹式动态变化为主：术后2 w阳性8例，3例持续阳性，2例术后30 d转阴，1例术后45 d转阴，2例术后60 d转阴，1例术后20 d转阴并于术后3个月转为阳性。

    2.3  肾功能改变  血Cr值的比较：嵌合阳性患者血Cr值为(95.83±25.64)μmol/L，阴性患者为 (110.50±33.24)μmol/L，两组比较差异无显著性(P>0.05)。

    2.4  嵌合患者与排斥反应次数的关系  未发生排斥者：阳性44例，阴性35例。出现排斥者：阳性2例，阴性8例。二者差异有显著性(P＜0.05)。

    3  讨论

    微嵌合状态（microchimerism）是指接受了同种实质性器官移植的受者体内可检测到供者的细胞或遗传物质的现象。同时，移植的组织内部分细胞如巨噬细胞则被宿主细胞代替，形成一种互相嵌合的状态。1991年Starzl[1]首次提出了嵌合现象可能存在于所有成功器官移植术后，认为微嵌合是指器官移植成功后供受体免疫活性细胞发生相互移行，各自被对方的组织相容性抗原激活而增殖，但在有效的免疫抑制下，移植物抗宿主反应（GVH）和宿主抗移植物反应（HVG）达到一种相对平衡无反应状态，形成供受体基因共存的微嵌合[2，3]。动态观察10例患者其术后的微嵌合现象，发现微嵌合在不同时间、不同患者中呈波形变化；早期微嵌合形成具有不稳定性，证明了双向免疫平衡处于调节阶段，可能与HLA配型、输血、排斥反应及免疫抑制剂的应用方案等因素有关，也有可能是机体在移植前已存在嵌合细胞[4]。本组存活18个月以上人群的嵌合发生率高于其他两组，表明随着移植物稳定生存时间的延长，微嵌合的发生率升高，表明嵌合现象与免疫耐受具有重要相关性。此结果与McDonald的研究报道一致，其研究认为肝移植受者体内高度稳定的供者可溶性HLA浓度是移植物长期稳定功能的特征[5]。

    微嵌合阳性患者急性细胞排斥反应发生率与阴性患者相比差异有显著性，提示微嵌合患者急性细胞排斥反应发生率低。但微嵌合阳性患者也有一定的急性细胞排斥反应发生率，国外亦有类似报道，一些已经形成了稳定微嵌合状态的肾脏、心脏和肝脏移植患者，同样发生了移植排斥，证实微嵌合状态并非总与良好的临床结果相一致[6，7]，提示供体白细胞的微嵌合状态实际上可能是由于免疫抑制的结果，是移植物不被排斥的伴随现象。也就是说，微嵌合现象可能是移植物长期存活的结果，而不是原因。王玉国等[8]报道采用供体骨髓输注促进微嵌合的形成，发现嵌合体的消失现象与急性排斥反应之间无相关关系，因此认为不能以嵌合体的消失作为诊断急性排斥反应的依据。

    我们认为微嵌合作为双向免疫平衡的产物，其不能预示受者在环境变化后的预后情况，而只能动态反应出当时的双向免疫平衡。尽管对所谓的“原因与结果”的争论，学界仍有不同的看法，但事实上Starzl本人也已承认，不能以微嵌合的存在与否来作为临床长期存活的器官移植受者停药的指标，也即微嵌合并不是移植耐受的充分证据。排斥反应由T细胞或抗体所介导的一个过程，不能单纯以某个时段的微嵌合状态来评价排斥的发生。微嵌合反映出供受者间HVG和GVH相互作用的平衡状态，并呈动态变化，可能是免疫耐受最终出现的结果。

【】
  [1]Iwaki Y,Starzl TE, Yagihashi A, et al. Replacement of donor lymphoid tissue in small-bowel transplants[J].Lancet,1991,337(8745):818-819.

[2]Starzl TE, Demetris AJ, Murase N, et al. Cell migration,chimerism, and graft acceptance[J]. Lancet,1992,339(8809):1579-1582.

[3]Lagaaij EL, Cramer-Knijnenburg GF, van Kemenade FJ, et al. Endothelial cell chimerism after renal transplantation and vas-cular rejection[J]. Lancet, 2001, 357(9249): 33-37.

[4]Koopmans M, Kremer Hovinga IC, Baelde HJ,et al.Chimerism in kidneys,livers and hearts of normal women: implications for transplantation studies[J].Am J Transplant,2005,5(6):1495-1502.

[5]McDonald JC, Adamashvili I, Zibari GB, et al. Serologic alloge-neic chimerism[J]. Transplantation,1997,64(6):865-871.

[6]Gupta S, Verfaillie C, Chmielewski D, et al. A role for extrarenal cells in the regeneration following acute renal failure[J]. Kid-ney Int,2002, 62(4): 1285-1290.

[7]Mengel M, Jonigk D, Marwedel M,et al. Tubular chimerism occurs regularly in renal allografts and is not correlated tooutcome[J]. J Am Soc Nephrol, 2004, 15(4): 978-986.

[8]王玉国,刘志刚,王泽新. 供体骨髓输注发生嵌合体与肾移植 急性排斥反应的关系[J]. 临床泌尿外科杂志,2005 ,20 (10) 597-602.