甲醛对小鼠生精细胞Bcl-2、Bax蛋白表达及超微结构改变的影响

【摘要】  目的:研究甲醛对小鼠睾丸生精细胞Bcl-2、Bax蛋白表达及超微结构的改变。方法:取24只雄性清洁级（ICR）小鼠，随机分为4组，每组6只，用0.2、2、20 mg/kg甲醛腹腔注射，每天一次，连续5 d，第6天用免疫组化法测定小鼠睾丸生精细胞的Bcl-2、Bax蛋白表达率；用电镜观察小鼠睾丸生精细胞超微结构变化。结果:小鼠睾丸生精细胞的Bcl-2蛋白表达率明显低于对照组，差异有显著性（P＜0.05），Bax蛋白表达率明显高于对照组，差异有显著性（P＜0.05）；电镜观察结果显示，各浓度甲醛能使生精细胞的细胞核、染色质、线粒体等超微结构发生不同程度的病理改变。结论:甲醛可使小鼠生精细胞Bcl-2和Bax蛋白表达及超微结构发生显著性改变，从而诱导细胞凋亡。

【关键词】  甲醛 Bcl-2 Bax 生精细胞

    Abstract:  Objective:To study the effects of formaldehyde on Bcl-2, Bax expression in spermatogenic cell of mice and ultrastructural changes in spermatogenic cell. Methods: Twenty-four male mice (ICR) were divided into 4 groups randomly, who were treated with formaldehyde of 0.2、2、20 mg/kg respectively one time a day, and lasted for 5 days, the Bcl-2, Bax protein expression rate was tested in the sixth day with the immunohistochemical method; and the ultrastructural changes of spermatogenic cell and sperm were observed under the transmission electron microscope. Results: Bcl-2 protein expression rates were lower than that of the contrast group, the difference had statistical significance（P<0.05）. Bax protein expression rate was higher than that of the contrast group, the difference had statistical significance（P<0.05）. The result under electron microscope showed that the ultrastructure of karyon, karyotin, mitochondria and karyotheca in each treated group had different degree of damage by serving formaldehyde in different concentrations.Conclusion: Formaldehyde exposure will cause the remarkable changes of Bcl-2, Bax protein expression, and ultrastructural changes in spermatogenic cell and sperm, which led to cellular apoptosis.

    Key words:  formaldehyde, Bcl-2, Bax, spermatogenic cell

    动物实验发现,甲醛具有生殖毒性和致细胞突变及致癌性[1]。对甲醛毒性研究一般集中在器官和组织水平，从分子水平探讨甲醛对机体损伤及细胞凋亡的研究国内较少。为了进一步研究甲醛睾丸细胞毒性和生殖细胞的调亡机制，本研究分析Bcl-2、Bax蛋白表达及小鼠睾丸生精细胞超微结构变化情况,报告如下。

    1  材料和方法

    1.1  主要试剂  AR甲醛（Formaldehyde，FA），由上海溶剂厂提供，Bal-2、Bax免疫组化试剂盒（购自武汉博士德生物制剂有限公司），戊二醛（购自医药集团上海化学试剂公司）环氧树脂（购自Epon812，Serva公司）。

    1.2  实验动物  清洁级健康雄性ICR小鼠，体重(25±2)g，由温州医学院实验动物中心提供（医动字22030002号）

    1.3  动物分组与处理  取32只雄性ICR小鼠，随机分成4组，每组6只，设A、B、C三个剂量组（0.2、2，20 mg/kg）和一个对照组（仅注射生理盐水）。每天注射一次，连续5 d，于第6天处死小鼠，取睾丸进行各项指标测定。

    1.4  Bcl-2、Bax蛋白免疫组化检测  每组各取15张睾丸石蜡切片按试剂盒操作说明书分别进行Bcl-2和Bax蛋白免疫组化反应。阴性对照用PBS代替一抗。

    1.5  图像分析及定量方法  在Bal-2和Bax免疫细胞化学染色涂片上，每组10个视野，在光镜10×40倍的视野下，采用Iproge-plus-5测量睾丸细胞表达Bcl-2和Bax蛋白光密度、阳性表达率。

    1.6  超微结构观察  取小鼠睾丸做戊二醛固定、环氧树脂包埋、超簿切片，日立H600型透射电镜观察。

    1.7  统计学处理方法  Bcl-2、Bax蛋白表达密度、阳性率、差异比较采用单因素方差分析。

    2  结果

    2.1  甲醛对小鼠睾丸生精细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响  三种浓度甲醛处理组小鼠睾丸生精细胞Bcl-2蛋白阳性表达率均明显低于对照组，差异有显著性（P＜0.01）；各浓度组睾丸生精细胞的Bax蛋白阳性表达率明显高于对照组，差异有显著性（P＜0.01），具体见表1。

    2.2  甲醛对小鼠睾丸生精细胞超微结构的影响  对照组的生精细胞染色质浅，核膜光滑，线粒体完整（见图1）。0.2 mg/kg剂量组睾丸生精细胞，染色质轻度浓集，核膜模糊，线粒体、内质网完整（见图2）；2 mg/kg剂量组睾丸生精细胞，染色质浓集成块，染色深，核膜进一步模糊，少数线粒体中度空泡（见图3）20 mg/kg剂量组睾丸生精细胞，染色质浓集成块，染色深，核膜溶解，少数细胞坏死，线粒体凝集，空泡明显（见图4）。

    3  讨论

    甲醛是一种已知致癌、致细胞突变的物质，有一定的遗传毒性。Bcl-2是最早在人类细胞中发现的调亡调控基因，Bcl-2蛋白是一种膜蛋白，主要分布于线粒体膜、核膜和内质网膜上[2]；Bax蛋白是Bcl-2家族的成员之一，是能与Bcl-2蛋白结合的同源分子，二者在细胞中的比例决定了细胞是否调亡，当Bcl-2蛋白在细胞中过量表达时，与所有Bax结合，细胞存活，调亡抑制。当Bax过量表达，与Bcl-2形成异源二聚体，则细胞凋亡[3]。本实验结果显示，在正常小鼠生精细胞胞质内有大量的Bcl-2蛋白和少量的Bax蛋白表达，三种浓度处理组的小鼠，甲醛浓度越高Bcl-2蛋白表达越少而Bax蛋白表达增加越明显，这与刘光伟等[4]和沈凯等[5]研究的结果相一致。我们认为Bax和Bcl-2通过各自的作用途径相互协同作用，共同诱导生精细胞的调亡。

    Taboga等[5]研究表明生精细胞发生凋亡最常见的形态变化是细胞核染色质浓缩，我们用电镜观察结果显示：对照组的小鼠生精细胞的超微结构，核内以常染色质为主，核膜光滑，线粒体完整，胞浆内粗面内质网发达；0.2 mg/kg剂量组睾丸生精细胞形态发生变化，染色质轻度浓集，核膜模糊，胞浆中线粒体、内粗面内质网完整；2 mg/kg组的细胞核结构进一步受损，表现为染色质浓集成块，染色深，核膜进一步模糊，线粒体凝集，内嵴残缺；而20 mg/kg组的电镜结构为核内染色质发生溶解，细胞核的核膜皱缩，线粒体浓缩，内嵴模糊，粗面内质网出现脱粒现象。是从三种剂量组细胞超微结构来看，甲醛的作用主要造成染色质的浓缩和线粒体的损伤，分别表现为核染色质的浓缩或溶解以及线粒体的肿胀和凝集。

【】
  [1] 李玲,许红霞,刘桂珠,等.甲醛对小鼠致突变作用的研究[J].宁夏医学院学报,2004,26(5):320-321.

[2] Nguyen M,Branton PE,Walton PA,et al.Role of membraneanchor domain of bcl-2 in suppression of apoptosis caused by E1B-defective adenovirus[J].J Biol Chen,1994,269(24):16521.

[3] Oltraii ZN,Milliman CL,Korsmeyer SJ et al. Bcl-2 H eterodimetizes in vivo with a conserved homolog,Bax,that accelerates programmed cell death[J].Call,1993,74(4):609.

[4] 刘光伟,童丽华,王珍琦,等.低剂量电离辐射对小鼠睾丸生精细胞P53和BCL-2蛋白表达的影响[J].吉林大学学报,2004,30(1):85-88.

[5] 沈凯,杨宇如,李虹,等. 输精管结扎对大鼠睾丸生精细胞Bcl-2、Bax蛋白质的表达[J].生殖与避孕,1999,19(1):11-15.

[6] Taboga SR,de Souza RS, dos Santos DC ,et al.Spontaneous germ cell death by apoptosis in epididymis of the adult bat artibeus lituratus[J].Cytobios,1999,99(390):39-45.