重组anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒的构建
【摘要】 目的:构建pLNCX/anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ的重组真核表达载体，转染PA 317细胞株，包装制备重组非复制型逆转录病毒。方法:采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/CD80的真核逆转录病毒载体pLNCX质粒上，转染PA 317细胞株，经G418筛选，收获上清液获非复制型逆转录病毒，将病毒感染NIH 3T3细胞株，用PCR、流式细胞术检测目的基因在NIH 3T3细胞中的表达情况，确定病毒滴度。结果:经酶切及测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20scFv/CD80/CD28/ζ的成功构建；采用PCR方法能够从逆转录病毒感染的NIH 3T3细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段；流式细胞术检测显示该目的基因能够在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白。结论:成功构建高滴度表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒，并能在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白。
【关键词】 单链抗体 逆转录病毒 PA 317细胞 基因表达 NIH 3T3细胞
Abstract: Objective: To construct recombinant eukaryotic expression vectors of pLNCX/anti- CD20scFv/CD80/CD28/ζ，transfect into PA 317 cells and package recombinant retroviruses. Methods:CD28-ζcDNA were amplified from plasmids pBULLET and inserted into pLNCX vectors that contained anti-CD20 scFv/CD80 gene. The recombinant plasmids were transfected into PA 317 cells and resistant clones were obtained by G418 selection. Retroviruses were harvested from culture medium of PA 317 cells. Then NIH 3T3 were transfected with retroviruses. After G418 selection, objective gene expression was determined with PCR and FACS. Results: The recombinant eukaryotic vector was constructed successfully with PCR, enzyme digestion analysis and objective gene was amplified from NIH 3T3 cells transfected with retroviruses with PCR; FACS showed that objective protein could be expressed in NIH 3T3 cells. At the same time viral titer was estimated. Conclusion: Recombinant retroviruses expressing anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ gene are successfully constructed and objective protein can be expressed in NIH 3T3 cells.
Key words: single chain fragment; retrovirus; PA 317 cells; gene expression; NIH 3T3 cells
机体抗肿瘤免疫主要是细胞免疫，而肿瘤细胞一般不表达或低表达B7分子及其他黏附分子，不能与CD28相互作用，从而难以诱导肿瘤特异性细胞免疫，使肿瘤逃避宿主免疫杀伤作用。为此，我们利用anti-CD20单链抗体（scFv）、CD80穿膜蛋白及T细胞活化信号CD28-CD3ζ构建表达pLNCX/anti-CD20scFv/CD80/CD28/ζ的非复制型高滴度逆转录病毒，为以后该逆转录病毒转染原代T淋巴细胞从而制备CD20靶向性嵌合锚定T细胞奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 含anti-CD20 scFv/CD80的pLNCX质粒由华盛顿大学单大铭博士惠赠，含CD28-ζ链的质粒pBULLET由德国科隆大学肿瘤研究所Hinrich Abken博士惠赠，所有RT-PCR试剂、PCR试剂、T4连接酶、DNA Ladder均购自Promeg公司，引物均由北京赛百盛公司合成，基因测序由上海联合基因公司完成，Topo TA cloning kit、质粒抽提及胶回收试剂盒和转染试剂盒Lipofectin2000均采用美国Invitrogen生物公司产品，所有流式细胞检测试剂均购自BD公司，RPMI 1640和DMEM购自Gibco公司，PA 317、NIH 3T3细胞株购于典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，菌种DH5α由本实验室保存。
1.2 引物的设计合成 按pBULLET上的CD3ζ-CD28 cDNA序列设计引物，上游引物5'-ATTATTATCGA TAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCC，下游引物5'-ATTATTATCGA TTTAGCGAGGGGGCAGGGCCTG，5'端分别设计有ClaⅠ的酶切位点。
1.3 重组表达载体pLNCX/anti-CD20scFv/CD80/CD28/ζ的构建及鉴定 以pBULLET质粒为模板,通过上下游引物进行PCR扩增反应,反应条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共25个循环，最后再于72 ℃延伸10 min，扩增产物回收纯化后与pCR-TOPO-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α,克隆筛选，挑取白斑摇菌提取质粒，行ClaⅠ单酶切及电泳鉴定，酶切阳性质粒送上海联合基因公司测序,将测序正确的pCR-TOPO/CD28/ζ载体行ClaⅠ单酶切，酶切产物回收与线性真核逆转录病毒表达载体pLNCX/anti-CD20 scFv/CD80连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取菌落送上海联合基因公司测序，与已知的序列分析进行比较。
1.4 含目的基因非复制型逆转录病毒的包装和滴度测定 以高纯度质粒抽提试剂盒（QIAgen plasmid Mega kit）提取质粒，按lipofectin2000转染试剂盒使用说明转染PA 317细胞株。48 h 后，更换新鲜DMEM培养液(10%的胎牛清，800 mg/L的G418，1×105 U/L的青霉素及100 mg/L的链霉素)，之后每天换液1次，3 w后细胞形成克隆，用滤纸法挑取单克隆，继续扩大培养至一定数量后收获培养上清。之后按照10倍稀释度稀释后感染NIH 3T3细胞进行滴度测定，根据下列公式病毒滴度:病毒滴度(CFU/ml)=细胞集落数×稀释倍数，同时将NIH 3T3细胞筛选3 w后获得的细胞克隆留取下一步实验用。
1.5 用PCR法检测重组质粒在NIH 3T3细胞中的表达 将筛选的NIH 3T3细胞用胰酶消化，取1×106个细胞，提取基因组DNA为PCR反应模板，加入步骤2中设计的上下游引物各0.5μl，先在94 ℃中变性5 min，然后于94 ℃中变性1 min，于55 ℃退火1 min，于72 ℃延伸1 min，共25个循环，最后再于72 ℃延伸10 min，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.6 FACS法检测重组质粒在NIH 3T3细胞中的表达 取4支试管，其中1、2两支加入转染的1×108 cells/ml的NIH 3T3细胞悬液各50μl，3、4两支加入未转染的1×108 cells/ml的NIH 3T3细胞悬液各50μl，4管中各加2 m1 PBS缓冲液洗涤细胞1次，加50μl PBS重悬细胞，参照试剂盒说明书进行细胞穿孔的操作，接着在1、3号试管中加入mouse IgG1 FITC 各5μl，2、4号试管中加入zeta FITC各5μl，轻轻混匀，避光孵育30 min后，PBS洗涤，300×g离心5 min，加入20 g/L多聚甲醛0.5 ml固定，避光孵育15 min后上机分析并用并用cellquest软件进行收集和分析图像数据。以侧向角散射(SSC)为纵坐标,前向角散射(FSC)为横坐标,绘制SSC/FSC散点图，采用设门技术(gating)圈出欲分析的细胞群体,检测该细胞群体表达细胞内zeta链的荧光强度。
2 结果
2.1 重组表达载体pLNCX/anti-CD20scFv/CD80/CD28/ζ的构建及鉴定 以pBULLET质粒为模板的PCR扩增产物大小为477bp，经电泳初步鉴定大小与已知序列相似，见图1。将该片段回收后克隆至pCR-TOPO-T载体上，重组质粒pCR-TOPO/CD28/ζ进行ClaⅠ单酶切，经电泳初步鉴定产物大小与已知序列相同，见图2，酶切阳性质粒测序结果证实了CD28-ζ基因序列正确，把测序正确的重组质粒pCR-TOPO/CD28/ζ用ClaI酶切切下CD28-ζ基因，与线性pLNCX/anti-CD20scFv/CD80连接，重组质粒pLNCX/anti-CD20scFv/CD80/CD28/ζ经测序，与已知的序列比较，序列及插入方向均正确。
2.2 含目的基因逆转录病毒的包装和滴度测定 将其转染包装细胞系PA317进行包装，收集病毒上清，按照10倍稀释度稀释后感染NIH 3T3细胞进行滴度测定，所测10份病毒平均滴度为（18.3±0.9）×105 cfu/ml。
2.3 用PCR法检测重组质粒在NIH 3T3细胞中的表达 病毒感染后NIH3T3继续扩增至一定数量后，提取细胞基因组DNA，采用特异引物进行PCR扩增，扩增产物为CD28-ζ的序列部分，从电泳结果可见获得了一个长度为477 bp的PCR产物条带，其大小与预期理论值相符，证实假病毒可以介导目的基因整合到感染细胞的染色体DNA中，见图3。
2.4 FACS法检测重组质粒在NIH 3T3细胞中的表达 将转染与未转染NIH 3T3细胞一道,通过FACS法检测细胞内ζ链表达的多少来查看目的蛋白的表达强弱，实验结果表明：只有转染的NIH 3T3细胞能检测到ζ链有90.42%表达，而且荧光强度较强，而未转染的PA 317细胞中没有ζ链的表达，证实了假病毒可以介导目的基因在感染细胞内表达目的蛋白，见图4。
3 讨论
目前基因临床应用项目中使用最多的前3种载体依次为:逆转录病毒载体(占总病例数的50.2%)，腺病毒载体(占总病例数的18.4%)和脂质体（占总病例数的17.7%[1]）。在本研究中，带有目的基因的pLNCX载体采用脂质体方法转染PA 317细胞系并经过包装，产生大量携带目的基因的非复制型重组逆转录病毒，经病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用而进入NIH 3T3细胞，之后反转录酶启动合成DNA并随机整合到NIH 3T3细胞基因组中。通过G418筛选之后转染效率达到了90%以上，并且目的蛋白呈高表达状态，NIH 3T3细胞高效率的成功转染为下一步开展原代T细胞的转染、体外杀伤能力的实验以及将来体内实验和临床应用奠定了基础。
用包装的逆转录病毒进行正常T细胞的转染，由于其为随机整合,有可能激活下游癌基因从而使细胞发生恶性转化。有报道称，在应用重组逆转录病毒感染造血干细胞，回输治疗因腺苷脱氨酶(AdA)基因先天缺陷引起的联合重症免疫缺陷病时,虽然取得了好的疗效,但部分患儿接受治疗数年后血中出现了白血病样病变细胞[2]。在接下来的研究中,我们将采用外周血T淋巴细胞作为重组逆转录病毒的感染细胞,它们是分化终末细胞，仅仅可以存活数月,一般不会转化成白血病样病变细胞，而且它们容易采集和进行体外培养，在抗肿瘤免疫中起着重要作用，同时此类病毒是经过改造的，与界中存在的逆转录病毒相比，它没有复制功能，只具备一次感染能力，不能在体内长期生存。总之，这种基因治疗方案相对来说比较安全，将来应用于临床治疗具有一定的可行性。
目前国外有学者成功将CD3分子ζ链基因和scFv基因融合为同一分子转染T或NK细胞，scFv和ζ链基因表达于同一分子上，其中scFv表达于T或NK细胞膜上与特异性抗原结合，ζ链表达于scFv之后行使信号转导功能，并把这一分子称为免疫重组受体。这种嵌合锚定T或NK细胞表面的scFv能特异性地与肿瘤细胞表面肿瘤相关抗原结合，相当于正常T细胞TCR与抗原肽-MHC结合，而前者不需要识别MHC。只要肿瘤抗原与scFv特异性结合，T或NK细胞便能够被激活，信号经ζ链进一步传导后，接下来的活化过程跟一般T细胞基本一致。经研究证实该融合基因能稳定地表达于T或NK细胞上并使此类T细胞对肿瘤特异性抗原细胞起特异性杀伤作用[3～6]。
目前国内外尚未有表达重组抗CD20 scFv/CD80/CD28/ζ细胞构建及用于相关治疗的报道，本研究为肿瘤特异性靶向T细胞的制备奠定了基础，为肿瘤的免疫学和生物学治疗提供了新思路，具有潜在的应用价值。
【文献】
[1] David HK, Robert L, Martuza RL, et al. Replication-selective virotherapy for cancer: Biological principles risk manage- ment and future directions[J]. Nat Med, 2001, 7 (7): 781-787.
[2]Günzburg W. Retroviral gene therapy[J]. Trends Mol Med, 2002, 7(9): 277-278.
[3]Dall P,Herrmann I,Durst B,et al.In vivo cervical cancer growth inhibition by genetically engineered cytotoxic T cells[J]. Can- cer Immunol Immunother, 2005,54(1):51-60.
[4]Daldrup-Link HE, Meier R, Rudelius M,et al.In vivo tracking of genetically engineered, anti-HER2/neu directed natural killer cells to HER2/neu positive mammary tumors with magnetic resonance imaging[J]. Eur Radiol, 2005,15(1):4-13.
[5]Schirrmann T, Pecher G. Specific targeting of CD33(+) leu-kemia cells by a natural killer cell line modified with a chi- meric receptor[J]. Leuk Res, 2005,29(3):301-306.
[6]张瑞萍,云琳,陆斌,等. 嵌合T细胞受体的构建及其在T淋巴细胞表面的表达和体外抗肿瘤功能的检测[J].中华实验外科 学杂志,2006,23(5):609－611.
