反相高效液相法测定莪术油凝胶剂中莪术醇和吉马酮含量

【摘要】  目的:建立反相-高效液相色谱法(RP-HPLC)测定莪术油凝胶剂中莪术醇和吉马酮的含量的方法。方法:在ODS-C18色谱柱上采用流动相乙睛-0.025 mol/L 磷酸(45:55)(三乙胺调节pH至4.5)溶液进行梯度洗脱：乙腈：0～5 min，70%; 5～30 min，70%→90%；30～50 min，90%。检测波长213 nm，流速1.0 ml/min。结果:在0.3～7μg范围内，莪术醇对照品的峰面积（Y）与其浓度（X）呈现良好的线性关系，r=0.9996，在0.3～7μg范围内，吉马酮对照品的峰面积（Y）与其浓度（X）呈现良好的线性关系，r=0.9997，平均回收率分别为98.37%和99.71%（n=9）。结论:本法专属性高，可同时测定凝胶剂样品中莪术醇和吉马酮的含量，可用于对莪术油凝胶剂的质量控制。

【关键词】  莪术油凝胶 莪术油 高效液相色谱法 莪术醇 吉马酮 含量测定

    莪术油(Zedoary Turmeric Oil)是从姜科植物蓬莪术(CurcumaphaeocaulisValeton)、广西莪术(Curcunta kwangsiensis S. G.Lee et C. F. Lung) 温郁金(Curcuma wenyujin Y.H. Chen et C. Ling)的干燥根茎中提取出的挥发油，呈浅黄或棕黄色，具有很强的挥发性[1]。温郁金为姜科姜黄属植物，主产于浙江省温州市瑞安一带，为浙江省道地中药材，人工栽培有千年，为著名的“浙八味”之一[2]，其中从温莪术中共提取分离出7个单体化合物，包括三种姜黄素类成分和四种挥发油成分[3]。现选用本地瑞安产莪术油为试样品，对其凝胶剂质量控制作出评价。莪术油葡萄糖注射液剂型作为抗病毒药收载于药典2000版二部，其含量测定是以莪术醇为对照品，经香草醛硫酸溶液显色后用比色测定的。莪术油凝胶剂作为一种新的剂型多用于黏膜局部用药，如眼部、阴道等，凝胶剂与传统注射剂相比，具有药物含量增加、滞留时间延长、生物利用度提高的优点。本研究建立了反相HPLC法测定莪术油凝胶剂中莪术醇和吉马酮含量的方法。

    1  仪器、试剂及条件

    1.1  仪器  UV-7502PC型紫外可见分光光度计(上海欣茂技术有限公司生产）；Agilent 1100高效液相色谱仪（四元泵，检测器VWD）；Agilent Chemstation 色谱工作站；AL204型分析天平（梅特勒-托利多公司生产）；18B-C型高速离心机（上海安亭仪器厂生产）。

    1.2  试剂及药品  乙腈（HPLC级），天津四友生物医学技术有限公司生产；甲醇(HPLC级），天津四友生物医学技术有限公司生产；吉马酮（分子量：206.32，中国药品生物制品检定所提供，批号：（111665-200401）；莪术醇(分子量：236.34, 中国药品生物制品检定所，批号：100185-200405）；莪术油试样品（瑞安天瑞）；莪术油凝胶剂（本院自制，批号为：0603051，0603062，0603093）；其他制剂均为分析纯。

    1.3  色谱条件  色谱柱：25 cm×4.6 mm，5μm，Hypersil ODS C18 反相色谱柱，流动相：乙睛-0.025 mo1/L磷酸(45:55)(三乙胺调节pH至4.5)梯度洗脱：乙腈：0～5 min，70%；5～30 min，70%→90%；30～50 min，90%，柱温：25 ℃，流速：1.0 ml/min，检测波长：213 nm，进样量20μl。

    2  方法和结果

    2.1  系统适应性试验  在1.3的色谱测定条件下，莪术醇与吉马酮峰形对称，保留时间分别约为20 min和26 min，理论塔板数>3000，分离度大于4，记录色谱图，结果见图2。

    2.2  最低检出量测定  调整检测灵敏度及进样量，测定峰高为基线噪声3倍时的进样量，作为检出限，按该方法测得的最低检测限为10 ng·ml-1，最低检测量为0.2 ng。

    2.3  标准曲线的制备  精密称取莪术醇对照品10 mg、吉马酮对照品10 mg分别置10 ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。另取莪术醇对照品溶液和吉马酮对照品溶液各5 ml于25 ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，得对照品混合溶液。精密量取对照品混合溶液2、3、4、6、10、15、18 ml，分别置25 ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，分别精密注入20μl，记录峰面积，以峰面积对浓度进行回归分析，得莪术醇回归方程为：Y=12765.7035X-34.1235(r=0.9996)，线性范围为0.3～7μg，吉马酮回归方程为：Y=63881.3685X+28.1730(r=0.9997)，线性范围为0.3～7μg。

    2.4  回收率试验  在葡萄糖注射液中加入莪术醇对照品、吉马酮对照品各适量，按上述色谱条件进样(20μl)，莪术醇和吉马酮的回收率，结果见表1、表2。

    2.5  精密度试验  取对照品混合溶液，在上述色谱条件下，连续进样5针(20μl)，以峰面积计算精密度，结果莪术醇和吉马酮的RSD分别为1.81%和0.7%。

    2.6  样品含量测定  取不同批次莪术油凝胶1.0 ml，置100 ml容量瓶中，以流动相稀释至刻度，摇匀，取一定量置于5 ml离心管中，以4000 r/min转速离心5 min，取上清液20μl进样，记录峰面积，代入回归方程计算，结果批号为0603051、0603062、0603093的样品含量分别为标示量的99.91%，100.10%，99.42%，结果见表3。

    3.1  分析方法的选择  莪术油的主要有效成分为莪术醇，但莪术醇的相对含量很小，而其他组分如吉马酮等的含量相对很高，因此，以选择吉马酮为含量测定目标成分，同时测定莪术醇的含量[4]。取吉马酮对照品，加入乙腈溶解并稀释制成5μg/ml的溶液，在UV-7502PC型紫外可见分光光度计上190～400 nm处进行扫描，莪术醇和吉马酮对照品的最大吸收波长分别在205 nm和213 nm，故以213 nm作为液相色谱检测波长。若采用UV方法测定凝胶剂中的吉马酮含量会有较大的误差，故本研究选择了专属性较高的HPLC法。

    3.2  流动相组成的优化  参照各类[5]，选用优化后流动相：乙腈-0.025 mo1/L 磷酸(45:55)(三乙胺调节pH至4.5)进行梯度洗脱：乙腈：0～5 min，70%；5～30 min，70%→90%；30～50 min，90%。检测波长213 nm，流速1.0 ml·min-1。结果表明: 凝胶样品中莪术醇与吉马酮的保留时间分别约为20 min和26 min，峰形比较对称，与其他组分峰分离度好，故选此条件作为流动相对本品的含量进行测定。

    3.3  小结  薄层色谱分析法不能准确测定莪术醇含量，而且莪术油中莪术醇含量并不高，现用反相HPLC法可以同时检测凝胶样品中的莪术醇和吉马酮的含量，操作简便，结果准确，重复性好，适用于莪术油凝胶剂的质量控制。

【文献】
  [1]李国栋,许付,沈爱军. 莪术油的研究进展[J].药学杂志,2002,37(11):806-809.

[2] 秦坤良,汤淙淙,黄可新. 温郁金茎叶与块根中挥发油成分的比较研究[J].温州医学院学报,2006,36(2):95-97.

[3] Wang Y, Wang MZ. Study on the quality of Rhizoma Curcumae [J].Acta Pharm Sin, 2001,36(11):849-853.

[4] 吴雨川,刘天扬,姜连阁,等. RP-HPLC法测定莪术油中莪术醇和吉马酮含量[J].中医药信息,2004,21(4):64-65.

[5] HE Hai-bing,TANG Xing,CUI Fu-de . High-performance liq- uid chromatographic method for determination of germacrone in rat plasma [J]. Journal of Chinese Pharma- ceutical Sciences,2004, 13(3):190-192.