先天性肺囊性腺瘤样畸形中SP-B、TTF-1与Ki-67表达的研究
【摘要】 目的:探讨表面活性蛋白B(SP-B)、甲状腺转录因子-1 (TTF-1)及核增殖抗原Ki-67在儿童先天性肺囊性腺瘤样畸形中的表达及其意义。方法:采用EliVision法进行免疫组织化学染色，52例先天性囊性腺瘤样畸形作为病例组，9例儿童正常肺组织作为对照组，检测SP-B、TTF-1、Ki-67在肺泡、呼吸性细支气管及囊壁组织中的表达与分布。结果:SP-B与TTF-1在正常肺组织及病例组中的表达部位、强度较一致，而在先天性肺囊性腺瘤样畸形不同组织亚型中表达强度明显不同。Ki-67在正常肺组织表达为阴性，在病例组中明显增加(P<0.01)，而在先天性肺囊性腺瘤样畸形不同组织类型中的表达强度差异无显著性（P>0.05)。结论:SP-B、TTF-1的表达与儿童先天性肺囊性腺瘤样畸形的组织分型密切相关，对了解先天性肺囊性腺瘤样畸形的组织发生具有重要意义；Ki-67与先天性肺囊性腺瘤样畸形的形成有关。
【关键词】 表面活性蛋白B 甲状腺转录因子 Ki-67 囊性腺瘤样畸形
Abstract: Objective: To investigate the expression of thyroid transcription factor 1（TTF-1）,surfactant protein B （SP-B） and Ki-67 in both pediatric congenital cystic adenomatoid malformation of lung（CCAM）and normal lungs; and their's value in histologic typing and formation of CCAM. Methods: Immunohistochemical method was used to detect the expression of TTF-1, SP-B and Ki-67 in 9 normal children's lungs and 52 congenital cystic adenomatoid malformation of lung cases. Results: The expression levels and parts of SP-B and TTF-1 were uniform. At the different typing of congenital cystic adenomatoid malformation of lung, the expression of TTF-1 and SP-B was different in quantity. In the control group, Ki-67 was not detected in the nuclei of epithelial cells lining the bronchus and alveoli pulmonis. The expression levels of Ki-67 in the diseased groups were significantly higher than those in the control group (P<0.05), but there was no significantly different among the diseased groups(P>0.05). Conclusions: TTF-1 and SP-B can serve as a marker for histologic typing of congenital pulmonary cyst. Ki-67 play an important role in the formation of the congenital pulmonary cysts.
Key words: TTF-1; SP-B;Ki-67; congenital cystic adenomatoid malformation of lung; immunohistochemistry
儿童肺组织的先天性囊性腺瘤样畸形（congenital cysticadenomatoid malformation of lung，CCAM）临床较少见，常伴有明显肺发育障碍和肺功能低下。表面活性蛋6B（Surfactant protein B，SP-B）是减小肺表面张力的主要功能蛋白，由肺泡Ⅱ型上皮细胞和支气管Clara细胞分泌。甲状腺转录因子-1（thyroid transcription factor 1，TTF-1）是一种核蛋白，参与肺的形态发生和肺表面活性物质的形成。核增殖抗原Ki-67可全面反映细胞群体的增殖活性。我们应用免疫组化EliVision法对9例儿童正常肺组织和52例CCAM中TTF-1、SP-B及Ki-67蛋白的表达情况进行检测，探讨它们在CCAM发生、中的作用。
1 材料和方法
1.1 材料 因其他疾病尸检的儿童肺组织9例作为正常对照组。病例组标本为我院及省儿童2000年至2006年、年龄≤15岁的少年儿童的CCAM手术切除标本的存档蜡块52例。根据Stoker标准[1，2]：CCAM 0型为致死性肺腺泡发育不良，直径＜0.5 cm，囊壁内衬假复层纤毛柱状上皮伴杯状细胞，壁内含平滑肌、腺体及软骨成分。Ⅰ型病变由单个或复杂的大囊腔组成,直径多＞2 cm，囊腔内衬覆假复层纤毛柱状上皮，部分上皮内含黏液细胞，囊壁较厚，包含薄层平滑肌和弹力组织，囊腔之间可见相对正常的肺泡。Ⅱ型病变由复杂的小囊腔组成，直径多＜1 cm，内衬纤毛柱状或立方上皮，囊壁内无软骨及黏液腺体，囊肿之间见类似呼吸细支气管与扩张的肺泡结构，常伴发其他畸形。Ⅲ型病变为巨大的非囊性的实性病变，其内为肉眼难以辨认的微囊，镜下为细支气管样结构，衬以立方或柱状上皮，部分含有纤毛。Ⅳ型囊壁内衬扁平肺泡上皮细胞和低柱状细胞。本实验标本根据上述标准分为CCAMⅠ、Ⅱ、Ⅲ型。
1.2 试剂及方法 全部标本均经10%中性甲醛固定，石蜡包埋, 4μm厚连续切片。采用EliVision法进行免疫组织化学染色。一抗均为鼠抗人单克隆抗体，TTF-1抗体购自北京中杉生物公司，SP-B、 Ki-67抗体购自福州迈新生物技术公司。具体步骤按试剂盒说明书进行。以PBS 代替一抗作阴性对照。
1.3 结果观察 SP-B在细胞质出现棕黄色颗粒为阳性表达；TTF-1和Ki-67以在细胞核出现棕黄色为阳性表达。选择具有代表性的多个高倍视野（×400）进行观察计数，每例随机选择上皮细胞数1 000个以上，阳性细胞占视野中上皮细胞总数的比例。细胞阳性率(%)=阳性细胞数/总细胞数×100%。
1.4 统计学处理方法 采用SPSS11.5统计软件进行分析。 阳性率计算以%为单位，取每组均数及标准差，用单因素方差分析和q检验进行统计。若方差不齐，采用非参数秩和检验方法进行比较。
2 结果
2.1 SP-B、TTF-1在正常肺组织和CCAM中的表达（见图1） 在正常肺组织，SP-B主要在远端细支气管的无纤毛柱状上皮及肺泡Ⅱ型上皮的细胞浆内表达。在病例组中，SP-B主要表达在囊壁的柱状上皮、立方上皮细胞的细胞浆内。在CCAMⅠ型28例中，囊壁上皮阳性细胞数约为1%，大多为柱状上皮显色，而纤毛柱状上皮为阴性；在CCAMⅡ型13例中，囊壁上皮阳性表达率约为40%，阳性细胞为单层柱状或立方上皮；CCAM Ⅲ型，囊壁上皮阳性细胞比例＞80%，主要在立方及柱状上皮细胞表达（见图2）。
在正常肺组织，TTF-1主要在远端细支气管的无纤毛柱状上皮及肺泡Ⅱ型上皮的细胞核内表达。在病例组中，TTF-1主要表达在囊壁的柱状上皮、立方上皮细胞的细胞核内。在CCAMⅠ型28例中，囊壁上皮阳性细胞数在1%左右，大多为上皮下基底细胞显色，而纤毛柱状上皮为阴性；在13例CCAM Ⅱ型中囊壁上皮阳性表达率为40%左右，阳性细胞为单层柱状或立方上皮，纤毛柱状上皮为阴性；CCAM Ⅲ型，囊壁上皮阳性细胞数均大于80%，主要为立方及柱状上皮表达（见图3）。
2.2 Ki-67在正常肺组织和CCAM中的表达（见表1） 在正常肺组织，Ki-67在支气管及肺泡上皮细胞核内偶见表达，其上皮细胞阳性表达率约为1%（见图4）；在CCAMⅠ～Ⅲ型中，Ki-67在囊壁的纤毛柱状上皮、无纤毛柱状上皮及立方上皮细胞的细胞核内均可见表达（见图5），其阳性表达率均明显高于正常肺组织，差异有显著性（均P＜0.01）；而在CCAM各亚型之间Ki-67阳性表达率差异无显著性 (均P＞0.05)。
3 讨论
肺先天性囊性腺瘤样畸形是一种肺发育异常, 占先天性肺发育畸形的25%左右[3]。以胎儿及新生儿居多，可出现胎儿水肿、新生儿呼吸困难，或无任何症状,可能是胎儿或新生儿的一种致死性病变。其具体发病原因目前尚不清楚。
TTF-1主要在起源于神经外胚层和内胚层的细胞类型中表达。在肺组织里，TTF-1主要分布在终末呼吸道，包括呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊和肺泡，早在胚胎12周即可见表达。TTF-1可以促进肺泡表面活性物质的合成(SP-A、SP-B及SP-C等)[4]。其中，SP-B是减小肺表面张力的主要功能蛋白，能插入到气-液界面的磷脂单分子层，降低肺泡表面张力[5，6]。人胚胎18周开始在支气管树表达，随着胚胎发育、肺组织成熟而表达增强。根据TTF-1和SP-B在正常肺组织及病变肺组织中的表达情况，推测CCAMⅠ型为近端支气管来源，在胚胎肺发育的早期即形成。而CCAMⅡ型囊壁上皮可见纤毛柱状上皮及无纤毛柱状上皮，同时TTF-I、SP-B的表达情况与远端支气管较相似，提示其可能为远端支气管来源，且形成时期相对较晚。在CCAM Ⅲ型的囊壁上皮二者均较强表达，与终末细支气管及肺泡Ⅱ型上皮表达较一致，由此推测其可能是终末细支气管及肺泡Ⅱ型上皮来源。
SP-B基因启动子区域有两个调节元件：一个是远侧的增强子，另一个是近侧区的基本启动子，其中含有多个TTF-1结合位点。SP-B的表达依靠(或至少部分依靠)TTF-1和HNF-3α的调控来完成[7]。在293和H441细胞，SP-B启动子能被TTF-1驱动，并具有TTF-1浓度依赖性，表明TTF-1在SP-B表达中起关键作用[8]。本实验结果显示，病例组及正常肺组织中SP-B的表达部位及强度和TTF-1有很大的一致性，在正常肺组织中，两者多表达在远端支气管上皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞中，强度也较一致；在病例组中，两者在CCAMⅠ型中均仅见散在的较弱表达，而在CCAMⅡ型中两者的阳性率均为40%左右，在CCAM Ⅲ型中囊壁上皮细胞的阳性率均大于80%。CCAM可伴发肺肿瘤,主要有支气管肺泡癌、鳞癌、肺母细胞瘤及横纹肌肉瘤等，其中以细支气管肺泡癌最常见。迄今报道CCAM伴发细支气管肺泡癌12例，全部病例均发生于含有黏液细胞的CCAMⅠ型，2例CCAMⅡ型病例伴发鳞癌[9]，而CCAMⅢ型是否会恶变尚未见报道，因此CCAM的正确病理分型对于预后判断非常重要。在本实验中，我们发现SP-B、TTF-1在CCAM的不同亚型中的表达强度有明显差异，因而可以作为CCAM病理分型的指标。
核增殖抗原Ki-67是细胞核内与细胞分裂及增殖相关的核蛋白，其表达与细胞增殖状态高度相关,是一个能反映细胞增殖活性的敏感指标[11]。本研究发现病例组中Ki-67的表达较正常肺组织明显增强（P<0.01），提示CCAM的发生与上皮细胞的异常增殖有关，细胞异常增殖可引起细胞畸变与突变，进一步演变成肿瘤的可能，因此它对于CCAM来说是一个不良的预后指标。
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