IFN-γ基因多态性与HBV感染不同结局之间的关系
【摘要】 目的:探讨IFN-γ基因多态性与HBV感染不同临床转归之间的相关性。方法:应用聚合酶链反应-序列特异性引物法（PCR-SSP）检测60例自限性HBV感染者(SR组)和118例慢性持续性HBV感染者［包括无症状HBV携带者(AsC组)36例和进展性肝病者82例（慢性乙型肝炎50例、乙肝后肝硬化32例）］的IFN-γ基因+874 T→A、+2109 A→G两个位点的多态性，比较各组间基因型和等位基因频率。结果:①+874 T→A位点多态性中,慢性持续性感染者总AA基因型频率比SR组显著升高（P<0.05）,差异有显著性。等位基因A的频率，进展性肝病组均显著高于SR组（P<0.05）。②+2109 A→G位点多态性中，进展性肝病组总GG基因型显著高于SR组(P<0.05），而肝硬化和慢乙肝组之间，SR和AsC组之间差别无显著性。结论:IFN-γ基因+874 T→A、+2109 A→G两个位点的多态性，与HBV感染不同结局之间有关，携带+874 T→A AA基因型和A等位基因的HBV感染者容易为慢性，A等位基因更趋向于进展性肝病，而携带+2109 A→G GG基因型患者则容易进展为慢性乙型肝炎甚至肝硬化。
【关键词】 干扰素-γ 慢性乙型肝炎 慢性HBV感染 基因多态性
Abstract: Objective: To explore the relativity between IFN-γ gene polymorphism and the clinical outcomes of HBV infection. Methods:A case-control study and PCR-SSP was used to detect IFN-γ+874 T→A and +2109 A→G polymorphism of 118 chronic HBV infected patients and 60 subjects which spontaneously recovered from HBV infection(SR group). The chronic HBV infection group included 36 asymptomatic HBV carriers (AsC group), 50 chronic hepatitis B and 32 HBVrelated liver cirrhosis. Results: The AA genotype frequency of IFN-γ+874 T→A was significantly higher in chronic HBV infection group than that of SR group（P<0.05）. The frequency of A allele was significantly higher in all advanced liver disease group (including chronic hepatitis B and liver cirrhosis) than that of SR group （P<0.05）. The GG genotype frequency of IFN-γ+2109 A→G was significantly higher in all advanced liver disease group than that of SR group (P<0.05）. Conclusion: The results suggest that IFN-γ+874 T→A AA genotype and A allele may be associated with susceptibility of chronic HBV infection. The A allele may be related with advanced liver diseases. IFN-γ+2109 A→G GG genotype may be related with susceptibility of chronic hepatitis B, even liver cirrhosis.
Key words: IFN-γ；chronic hepatitis B；chronic HBV infection；gene polymorphism
IFN-γ不仅在机体先天性和后天性免疫反应中起重要调节和效应功能，而且还是一种重要的抗纤维化和促进纤维溶解的细胞因子，因而在机体抗HBV感染及其引起的肝纤维化的过程中发挥着重要的作用[1]。人IFN-γ基因位于第12号染色体q24.1，它包含4个外显子和3个内含子，其多态性可通过影响IFN-γ的转录，导致不同的个体IFN-γ的产量不同，从而影响疾病的转归。目前已有研究发现IFN-γ+874、+2109、+183等位点多态性与HBV感染相关[2-4]，但其与HBV感染引起的肝纤维化的相关性研究目前国内外还罕见报道。因此，我们选取了IFN-γ+874、+2109两个位点，对其与HBV感染不同的临床转归进行了相关性研究，期望能够为判断患者的预后、临床使用IFN-γ提供依据。
1 对象和方法
1.1 对象 所有研究对象均为2006年12月至2007年12月本院住院或门诊就诊患者。严格按照中华医学会肝病学分会和感染病学分会2005年制定的《慢性乙型肝炎防治指南》及2000年的《病毒性肝炎的防治方案》进行疾病的规范化诊断，并分为如下几组：①自限性HBV感染组（spontaneous recovery，SR组）：HBeAb、HBcAb、HBsAb中至少两项阳性，但HBsAg及HBV DNA均为阴性，且均未接种过乙肝疫苗。共60例。②慢性持续性HBV感染组(persisting chronic infection，PC组)：共118例，包括无症状HBV携带者（asymptomatic carriers，AsC组）36例和进展性肝病组82例，后者包括慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CH)50例、肝硬化(Liver cirrhosis，LC)32例。所有研究对象均为无亲缘关系的汉族人，均无原发性心、肺、肾及高血压等病史，排除其他慢性肝病的致病因素存在，如非HBV病毒感染、自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、脂肪肝等。所有入选对象的临床特征见表1。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成：从GenBank下载人IFN-γ基因全部序列（登录号：AF375790[gi:14278712]）应用PRIMER 5.0，针对+874 T→A、+2109 A→G两个多态性位点，由上海基康公司设计和合成2对引物，见下表2。
1.2.2 人类基因组DNA提取：取EDTA抗凝静脉血2 ml，分装，-20 ℃冻存，采用大连宝生物公司提供基因组提取试剂盒提取基因组DNA，-20 ℃分装冻存。
1.2.3 聚合酶链反应（PCR）条件：IFN-γ的PCR扩增反应体系均为20μl，10×PCR Buffer(含镁离子)2.0μl，25 mmol/L dNTP 0.16μl，目的引物各10μmol/L 0.8μl，内参引物10μmol/L 0.16μl，模板DNA 100 ng/μl（+874位点5.0μl，+2109位点0.5μl），Taq DNA聚合酶1 U/μl 0.1μl，加去离子水至20μl。把PCR反应管置PCR仪中，+874位点：95 ℃预变性4 min后进入循环扩增，即先94 ℃变性30 s,55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，重复10个循环后，再进入第二次循环，即：94 ℃变性30 s，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，重复23个循环后于72 ℃再延伸6 min。+2109位点：95 ℃预变性4 min后进入循环扩增，即先94 ℃变性30 s，64 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，重复10个循环后，再进入第二次循环，即：94 ℃变性30 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，重复23个循环后于72 ℃再延伸7 min。
1.2.4 扩增产物的分析：5μl扩增产物与1μl上样缓冲液混合，用移液器将样品及DNA分子量参照物依次加入已配置的凝胶样品槽内。盖上电泳槽，以电压100 V电泳30～45 min，电泳结束后切断电源，取出凝胶，在紫外凝胶成像系统下观察结果。
1.3 统计学处理方法 全部数据输入机，用Microsoft Excell软件处理，基因频率采用直接计数法，组间比较采用x2检验。
2 结果
2.1 IFN-γ+874 T→A和+2109 A→G多态性位点基因型判断 IFN-γ+874多态性位点的扩增产物长度为527 bp，+2109多态性位点的扩增产物长度为934 bp，每两个孔道组成基因型，图1和图2从左到右分别为LC组（1、2泳道）、CH组（3、4泳道）、AsC组（5、6泳道）和SR组（7、8泳道）四组患者两个位点的代表基因型。
2.2 基因型频率分析（均符合Hardy-Weinberg定律）
2.2.1 +874 T→A位点多态性频率：此位点TT、TA、AA三个基因型，组成T、A两个等位基因，分布频率见表3。PC组总AA基因型的频率（30.5%）显著高于SR组（11.7%），差异有显著性（x2=7.71，P<0.05），其中AsC组、CH组、LC组分别与SR组相比（x2=4.01，P<0.05；x2=6.82，P<0.05；x2=5.31，P<0.05）差异有显著性，AsC组、CH组、LC组三组间差异均无显著性。A等位基因的频率，CH（53.0%）、LC组（53.1%）均显著高于SR组（36.7%），差异有显著性（x2=7.01，P<0.05；x2=4.63，P<0.05）。其他各组间差异无显著性。
2.2.2 +2109 A→G位点多态性频率：此位点存在AA、AG、GG三个基因型，A、G两个等位基因，分布频率见表4。进展性肝病组（CH+LC）总GG基因型频率（41.50%，）显著高于SR或AsC组（分别为20.0%、19.4%），差异有显著性(x2=5.35，P<0.05；x2=6.95，P<0.05）：其中CH组、LC组分别与SR比较差异有显著性（x2=5.29，P<0.05；x2=5.81，P<0.05）；CH组、LC组分别与和AsC组比较（x2=4.11，P<0.05；x2=4.69，P<0.05），差异有显著性，而CH和LC两组之间、AsC组与SR两组间，以及A、G两个等位基因频率在各组间差异均无显著性。
3 讨论
HBV感染机制尚不清楚，除了与HBV病毒本身（病毒含量、病毒变异、病毒基因型等）、环境因素有关外，宿主机体的免疫状况等具有重要的影响作用。近年来发现宿主抗HBV（特别是与免疫和炎症有关）的基因的多态性，在HBV感染后不同的临床转归及其易感性方面也发挥着重要的作用。
机体清除HBV需要先天性和后天性细胞和体液免疫反应的共同参与，在这个过程中细胞因子起着非常重要的作用。IFN-γ是一种重要的Th1类细胞因子，主要由活化的T细胞（包括Th0、Th1细胞和几乎所有的CD8+T细胞）和NK细胞产生，它可通过促进抗原提呈细胞和淋巴细胞的增殖、分化及活化，促进多种细胞表达MHCⅠ类和Ⅱ类分子等机制在机体抗病毒和免疫调节反应中发挥重要作用。在HBV转基因小鼠的试验中发现，CD8+T细胞和Th细胞还有NK细胞在识别了HBV病毒抗原后能够通过分泌IFN-γ抑制肝脏中HBV的复制[5]。Suri等[6]进一步的实验证实IFN-γ能够通过非细胞溶解机制抑制HBV病毒的转录和复制，提示IFN-γ除了通过调节机体免疫反应抑制HBV复制外，还能够通过非细胞损伤机制在病毒复制和转录水平直接抑制肝细胞内HBV的复制。
另外，IFN-γ是一种重要的抗纤维化和促进纤维溶解的细胞因子。肝纤维化是慢性乙型肝炎为肝硬化的一个可逆性的中间过程，表现为过量的细胞外基质（ECM）在肝脏的弥漫性沉积。肝星状细胞（HSC）是产生ECM的主要细胞。根据一些临床和动物实验研究，认为IFN-γ可能通过以下几个机制抑制肝纤维化的发生和发展：①抑制HSC的活化和增殖，促进活化的HSC凋亡，从而减少ECM的产生。②降低Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA的水平，直接抑制胶原的合成。③通过在转录后水平增加胶原酶（MMP1、MMP3）基因的表达，减少MMP抑制因子（TIMP）的表达，使胶原的降解增加、沉积减少。④降低肝组织和血中TGF-β1水平，或经由STAT磷酸化途径上调Smad7的表达，从而损害TGF-β信号途径，间接抑制肝纤维化。⑤通过免疫调节机制，抑制促进胶原合成的各种细胞因子活性，如白介素-4、白介素-2等[7，8]。Weng等[9]还发现体内IFN-γ的水平与肝纤维化的程度相关，高水平的IFN-γ能降低肝纤维化发生的危险性。
IFN-γ基因具有多态性，其中IFN-γ+874 T→A位点位于IFN-γ基因第一个内含子的转录起始位点下游第874 bp位置，位于CA重复序列的5'末端，其多态性与CA重复次数相关，且正好与转录因子NF-κB的结合位点相符合，其多态性可能直接影响到IFN-γ的产量。TT基因型是IFN-γ的高表达基因型，AA是低表达基因型[10]。IFN-γ+2109 A→G位点位于IFN-γ基因的第三内含子区，此区的多态性能够调节NFs（核因子）与IFN-γ基因的结合，从而可能会影响IFN-γmRNA的表达水平[10]。因此我们通过本实验对IFN-γ基因这两个位点与HBV感染的不同临床转归进行了研究与分析。
我们的研究结果显示，IFN-γ+874 T→A和+2109 A→G位点的多态性与HBV感染不同的临床结局具有明显的相关性。携带+874 T→A AA基因型和A等位基因的HBV感染者容易发展为慢性，且A等位基因在进展性肝病组明显升高，携带+2109 A→G GG基因型的患者则容易进展为慢性乙型肝炎甚至肝硬化。这些均提示+874 T→A AA基因型可能是慢性HBV感染的易感基因型，A等位基因可能与慢乙肝病情进展有关。+2109 A→G GG基因型是慢性活动性肝病的易感基因型。这与Zhang PA等[4，11，12]发现携带IFN-γ+874 T→A位点AA基因型的HBV的感染者容易发展为慢性及Meiqiang Liu等[3]认为基因型AG(包括+874 A和+2109 G)与人群的HBV的易感性相关等较一致，但还有待于进一步大样本地研究。
HBV感染是一个非常复杂的多因素、多基因共同作用的过程，其中宿主机体抗病毒免疫反应的强弱非常关键，而IFN-γ是机体的一种重要的免疫反应调节和效应因子，在机体抗HBV感染的过程中发挥着重要的作用，且其功能的强弱与其表达的量密切相关。本实验探索了IFN-γ基因多态性与HBV感染之间的关系，并对其与HBV感染后的肝硬化进行了进一步的研究，发现+874 T→A和+2109 A→G位点的多态性与HBV感染不同的临床结局具有明显的相关性。但由于本实验还有许多不足，因此，进一步详细的研究将为阐明HBV感染后不同临床结局的发病机制提供可靠的依据，从而有助于乙型病毒性肝炎的防治。
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