Herceptin下调HER2表达后对PI3K/Akt通路蛋白表达的影响

【摘要】  目的:研究Herceptin下调乳腺癌细胞HER2表达对PI3K/Akt通路相关蛋白表达的影响，探讨该通路在Herceptin抗肿瘤效应中的作用。方法:Herceptin处理HER2过表达的乳腺癌细胞株SKBR-3，免疫细胞化学检测HER2、p21Cip1和p27Kip1的表达，Western blot检测p-Akt和Bad的表达。结果: Herceptin处理组细胞HER2阳性表达率（37.4%）显著低于对照组（78.3%）（P<0.01）。Herceptin处理组与对照组比较，p-Akt蛋白含量降低53.5%（P<0.01），Bad蛋白含量升高0.83 倍（P<0.01）。Herceptin处理组细胞p21Cip1和p27Kip1阳性表达率（分别为67%和56.1%）显著高于对照组（分别为19%和21.4%）（P<0.01）。结论:Herceptin下调HER2表达后，通过下调p-Akt表达而上调其下游Bad、p21Cip1和p27Kip1的表达，从而抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡。

【关键词】  Herceptin HER2 PI3K Akt通路 乳腺癌

    Abstract:  Objective: To evaluate the influence of downregulated HER2 expression by Herceptin of breast cancer cells on the related protein expression via PI3K/Akt pathway, and to investigate the action of this pathway in the anti-tumor effect of Herceptin. Methods: The HER2 overexpressed breast cancer cell line SKBR-3 was treated with Herceptin, the expressions of HER2, p21Cip1 and p27Kip1 were detected by immunocytochemistry, and the expressions of p-Akt and Bad were detected by Western blot. Results: The rate of HER2 positive cells of Herceptin treated group(37.4%) compared to the untreated group(78.3%) decreased significantly (P<0.01). Compared to the untreated group, the amount of p-Akt protein of Herceptin treated group decreased significantly to 53.5% (P<0.01), the amount of Bad protein of Herceptin treated group increased significantly by 0.83 fold(P<0.01). The rates of p21Cip1和 p27Kip1 positive cells of Herceptin treated group（67% and 56.1% respectively）compared to the untreated group（19% and 21.4% respectively）increased significantly (P<0.01). Conclusion: Herceptin can downregulate HER2 expression, to downregulate p-Akt expression and then to upregulate the expression of its downstream protein Bad, p21Cip1 and p27Kip1, thus to inhibit the proliferation and promote the apoptosis of tumor cells.

    Key words:  Herceptin; HER2; PI3K/Akt pathway; breast cancer

    HER2/neu基因(又名c-erbB2)编码跨膜受体型酪氨酸蛋白激酶，其过表达见于多种类型的肿瘤，在乳腺癌中的过表达率达30%，并且其与不良的预后和对放化疗的低敏感性密切相关。体内外实验研究表明，应用抗HER2/neu 的单克隆抗体Herceptin下调HER2的表达，能使细胞生长减慢，并能显著提高对放化疗的敏感性。HER2/neu能够发生自身激活，通过PI3K/Akt通路，导致恶性肿瘤的发生[1，2]。现就Herceptin下调乳腺癌细胞HER2的表达对PI3K/Akt通路相关蛋白p-Akt、Bad、p21Cip1和p27Kip1表达的影响进行研究，探讨该通路在Herceptin抗肿瘤效应中的作用。

    1  材料和方法

    1.1  细胞培养和Herceptin处理  HER2过表达的乳腺癌细胞株SKBR-3购自湖南远泰，采用DMEM（Invitrogen）加10%胎牛血清（杭州四季青），于37 ℃、5% CO2培养箱（Thermo Forma 3111）中培养。依SKBR-3细胞Herceptin（Genentech）MTT试验，IC50为1μg/ml处理48 h。本研究采用1μg/ml Herceptin处理48 h来下调HER2的表达为处理组，未作任何处理为对照组。

    1.2  HER2、p21Cip1和 p27Kip1表达的检测  经多聚甲醛固定的培养细胞的爬片（检测HER2和p21Cip1）和经乙醇固定的培养细胞的石蜡包埋切片[3]（检测p27Kip1），采用免疫组化S-P试剂盒（福州迈新），DAB显色，苏木素复染。HER2阳性表达（棕色）位于细胞膜和（或）细胞浆，p21Cip1和p27Kip1的阳性表达（棕色）分别位于细胞浆和细胞核。高倍镜下随机选取几个视野观察1 000个细胞，得出阳性细胞百分率并拍照。

    1.3  Western blot检测p-Akt和Bad的表达  收集细胞，以细胞裂解液处理，制备蛋白样品，测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE变性电泳。将蛋白转移至PVDF膜（上海密理博）。一抗采用兔抗人磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）多克隆抗体（1:500，Cell Signaling）、兔抗人BAD单克隆抗体（1:200，武汉博士德）和兔抗人β-actin单克隆抗体（1:200，北京赛驰）。二抗采用HRP标记的羊抗兔IgG（1:1000，北京赛驰），行DAB显色。采用预染蛋白Marker。实验重复3次以上，内参采用β-actin，Gel-Pro Analyzer4.0软件分析蛋白条带积分吸光度（IA）值。

    1.4  统计学处理方法  两组率的比较采用x2检验，两组均数比较采用t检验。

    2  结果

    2.1  Herceptin处理SKBR-3细胞对HER2表达的下调  对照组（见图1a）HER2阳性细胞率为78.3%，处理组（见图1b）HER2阳性细胞率为37.4%，二者差异有显著性（P<0.01）。

    2.2  HER2表达的下调对p21Cip1和p27Kip1蛋白表达的影响  抗p21Cip1和抗p27Kip1免疫组化结果：对照组（见图2a和图3a）p21Cip1和p27Kip1阳性细胞率分别为19.1%和21.4%，明显低于处理组（见图2b和图3b）（分别为67.3%和56.1%），二者差异有显著性（P<0.01）。

    2.3  HER2表达的下调对p-Akt和Bad蛋白表达的影响  Western blot结果（见图4）显示：用β-actin作为内参校正后，处理组较对照组p-Akt蛋白含量降低53.5%[(2.06±0.06)vs(4.43±0.39)，t=10.3，P<0.01]，Bad蛋白含量升高0.83倍[(0.75±0.03)vs(0.41±0.02)，t=17.2，P<0.01]。

    3  讨论

    本研究显示，处理组较对照组HER2阳性细胞率下降，证实Herceptin能特异性地作用于HER2过表达的细胞，下调HER2的表达。

    真核生物对生长因子等刺激产生应答，激活细胞内不同信号传导通路，其中PI3K/Akt是与细胞增殖和细胞凋亡关系最密切的信号传导通路之一[4]。IA型PI3K是酪氨酸激酶受体（如HER2）传递信号的重要转导子[5]。细胞膜HER2受生长因子等刺激后，细胞内PI3K（磷脂酰肌醇-3羟基激酶）活化，进而磷酸化其底物PIP2使其转化为PIP3[6]。Akt（蛋白激酶B，PKB）和PIP3结合，前者的Thr308和Ser474位点因磷酸化而被激活[7]，活化的Akt可能进一步激活其下游分子mTOR[8]等。

    Zhou等[9]研究发现，Akt的磷酸化水平从正常乳腺上皮组织、不典型增生到恶性转化，再到肿瘤侵袭转移渐次增加，且与HER2的过表达呈正相关。本研究显示，下调HER2表达后，p-Akt 蛋白含量明显降低，与Zhou等结论一致。有分析表明，Akt或mTOR磷酸化水平升高均与无病生存期缩短有关。因此，Herceptin下调HER2表达后，可能通过降低Akt或mTOR磷酸化水平而延长无病生存期。有报道称Herceptin诱导的PI3K和Akt抑制为其发挥抗肿瘤作用所需[10]。另有报道称，在MKN胃癌细胞中，Herceptin未下调PI3K，也未抑制肿瘤细胞生长[11]。由此推测，对于不同肿瘤细胞，Herceptin不一定都是作用于PI3K/Akt信号传导通路的，其临床疗效不同可能与其是否下调PI3K/Akt信号有关。

    PI3K/Akt信号传导通路在肿瘤发生、中的主要作用有：①抑制细胞凋亡：Akt可调控多个与细胞凋亡有关的蛋白家族从而抑制凋亡。②促进细胞周期进行：PI3K可通过Akt、mTOR传递有丝分裂信号，使细胞周期主要蛋白如cyclin、CDKs的翻译上调，使细胞周期加速[12]。③促进血管形成。④促进肿瘤侵袭。Hanada等[13]研究表明Akt能抑制前凋亡蛋白Bad及caspase-9的活性。本研究结果显示，下调HER2表达后p-Akt蛋白含量明显降低，Bad蛋白含量明显升高，与Hanada等结论一致，因此，Herceptin下调HER2表达，可能通过促进Bad表达而促进细胞凋亡。在对卵巢癌及前列腺癌的研究中均发现，抑制PI3K活性可诱导CDKs抑制p21Cip1的表达，抑制细胞周期进展[12,14]。在黑色素瘤及骨肉瘤细胞株中，PI3K抑制剂可以诱导CDKs抑制p27Kip1的表达，从而抑制癌细胞的增殖[14]。Akt对CKIs如p21Cip1[15]和p27Kip1[10，15]的表达具有负调节作用。本研究结果显示，下调HER2表达，抑制PI3K通路后，p21Cip1和p27Kip1表达上调，与以上结论一致。因此，Herceptin下调HER2表达后，可能是通过促进p21Cip1和p27Kip1的表达，进而抑制细胞周期进展、抑制肿瘤细胞的增殖。

【】
  [1] Zhou BP, Hu MC, Miller SA, et al. HER-2/ neu blocks tumor necrosis Factor-induced apoptosis via the Akt/ NF-kappaB pathway[J]. J Biol Chem, 2000, 275(11) : 8027-8031.

[2] Sabbatini P, McCormick F. Phosphoinositide 3-OH kinase (PI3K) and PKB/Akt delay the onset of p53-mediated, tran-scriptionally dependent apoptosis[J]. J Biol Chem,1999, 274(34) :24263-24269.

[3] 高洁, 侯敏, 刘彤华. 培养细胞的石蜡包埋切片用于免疫组织化学染色的优越性[J]. 中华病杂志,1999,28(6):459-460.

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[9] Zhou X, Tan M, Stone Hawthorne V , et al. Activation of the Akt/mammalian target of Rapamycin/4E-Bp1 pathway by ErbB2 overexpression predicts tumor progression in breast cancers[J]. Clin Cancer Res, 2004, 10(20): 6779-6788.

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