突触内NMDAR通道电流在培养神经元发育中的变化
作者：田映红， 胡德辉， 李树基， 陈明， 高天明
【摘要】 【目的】 观察培养大鼠海马神经元突触内NMDA受体（NMDAR）通道电流在发育中的变化。【方法】 取新生1 d SD大鼠海马制成细胞悬液，接种在培养板上进行培养。培养到1周和2周时，采用膜片钳全细胞模式记录神经元突触内自发的微小兴奋性突触后电流（mEPSC）。【结果】 培养2周海马神经元突触内NMDA受体介导的mEPSC（mEPSCNMDA）幅度比培养1周神经元小，对NR2B的特异拮抗剂ifenprodil的敏感性降低。Ifenprodil对培养1周神经元mEPSCNMDA的抑制作用达到（80.47±6.12）％，却只抑制（12.27±2.02）％培养2周神经元的mEPSCNMDA。【结论】 培养海马神经元突触内NMDA受体通道电流有发育变化，提示培养1周神经元突触内NMDA受体NR2亚单位主要为NR2B；而神经元培养到2周时，突触内NR2B亚单位逐渐被NR2A取代。
【关键词】 海马神经元； N-甲基-D-天冬氨酸受体； 膜片钳记录； 突触； mEPSC
甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）是中枢神经系统中谷氨酸受体的一种类型，主要由2个NR1和2个NR2亚单位组成。NR2分为4种亚型，分别是NR2A，NR2B，NR2C和NR2D，海马和皮层神经元主要是NR2A和NR2B。近年来的研究提示突触内和突触外NMDAR在突触可塑性、细胞内信号级联及兴奋毒方面的作用不同[1-3]，因此明确突触内、外NMDAR的亚单位组成对研究突触内、外NMDAR参与不同功能具有重要作用。以前的研究发现突触内、外NMDAR存在发育变化，但对突触内NMDAR在发育中变化的研究基本都采用全细胞模式记录诱发的兴奋性突触后电流（evoked-excitatory post-synaptic current, eEPSC）[4，5]。这种方法往往会激活一部分突触外NMDAR，并且不是真正意义上的生理活动，因此本文采用膜片钳全细胞模式记录培养1周和2周海马神经元突触内NMDAR介导的自发的mEPSC，同时利用NR2B的特异拮抗剂ifenprodil来观察培养海马神经元突触内NMDAR通道电流在发育中的变化，为探讨不同亚型NMDAR参与不同作用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及试剂
新生1 d SD大鼠。试剂：DMEM/F12、neurobasal培养基(Gibico)；胎牛血清（杭州四季青公司）；乙二醇双(2-氨基乙基)四乙酸（EGTA，上海生工）；多聚赖氨酸、阿糖胞苷、胰蛋白酶、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、甘氨酸、荷包牡丹碱（bicuculline methiodide）、士的宁（strychine）、河豚毒（TTX）、ifenprodil、6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX)、2-氨基-5-磷酸基戊酸(d-APV)、钾盐（K2ATP）均为Sigma产品；余为国产分析纯。
1.2 方 法
1.2.1 大鼠海马神经元的分离和培养 新生1 d SD大鼠，分离海马并去除血管及脑膜，将海马剪成小块，经2.5 g/L胰蛋白酶作用15 min（37 ℃），用含胎牛血清的完全培养基（DMEM/F12）终止消化，吸管轻轻吹打组织块以分散细胞。将细胞悬液经400目尼龙网过滤，900 × g离心7 min，沉淀加完全培养基重悬，调细胞密度为1 × 106/mL，然后将细胞悬液加入事先包被多聚L-赖氨酸的培养板中，置于37 ℃，体积分数5％ CO2培养箱内培养。24 h后将完全培养基换成neurobasal培养基（含2％ B-27），并加入5 μmol/L阿糖胞苷以抑制胶质细胞增殖。以后每3 d换液1次。
1.2.2 膜片钳记录 原代海马细胞培养到6～7 d或13～15 d，用来进行膜片钳实验。所有实验均在室温下进行（22～25 ℃）。记录用的玻璃微电极用硬质厚壁玻璃拉成玻璃毛坯，再用P97微电极拉制器分3～4步拉制微电极，电极尖端直径为1 μm左右。用pClamp 9.0进行记录。记录到的信号经1～2 kHz低通滤波，并用digidata 1320进行10 kHz数字滤波。采集到的数据存入机以备以后分析处理。全细胞模式记录自发的mEPSC，钳制电压为-60 mV，玻璃微电极的充灌电阻为3～5 MΩ。浴槽液成分包括(mmol/L)：140 氯化钠, 5 氯化钾, 1.3 氯化钙, 25 N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）, 33 葡萄糖, 0.02 荷包牡丹碱 (抑制γ-氨基丁酸受体)，0.001 士的宁（抑制甘氨酸受体），0.001氨基酸，0.001 TTX（抑制动作电位），pH 7.4，调渗透压为 320 mmol/L。电极内液成分包括(mmol/L)：140 氯化铯, 2 氯化镁，2.5乙二醇双(2-氨基乙基)四乙酸（EGTA）, 2四乙铵, 4三磷酸腺苷钾盐（K2ATP）, 10 N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES），pH7.4，调渗透压为300～310 mmol/L。
在整个实验过程中监测输入电阻和串联电阻。输入电阻为 500～800 MΩ，串联电阻为 20～30 MΩ。若实验中输入电阻或串联电阻变化超过20%，则弃去该细胞。每个神经元记录到的事件数要大于30，用软件Minianalysis 6.0进行分析。分析时幅度小于三倍基线噪声的事件被排除。
1.2.3 数据统计 实验数据用均数±标准差（ｘ±ｓ）表示。SPSS 11.0软件包进行统计分析。
2 结 果
2.1 mEPSC 幅度随发育的变化
mEPSC包括一快速衰减的成分和后面跟着的一缓慢衰减的成分（图1B中实线）。快速衰减的成分由a氨-甲基-异恶唑-丙酸受体（AMPAR）介导（mEPSCAMPA），可被5 μmol/L CNQX（AMPAR特异阻断剂）快速阻断；缓慢衰减的成分由NMDAR介导（mEPSCNMDA），可被100 μmol/L d-APV完全抑制（图1B中点线）。由于mEPSCNMDA的幅度小，很难从背景噪声分离出来，因此我们将d-APV作用前后的电流相减，即可间接得到mEPSCNMDA（图1B中点线）。统计结果显示培养2周的神经元mEPSCNMDA的平均幅度比培养1周小（t= -3.645, P=0.004），但mEPSCAMPA的幅度相应增大（t=3.162, P=0.009），而总mEPSC的幅度无差异（图1 C、D，t=0.281, P=0.780）。这些结果表明突触内mEPSC的幅度存在发育变化。
2.2 NR2B特异拮抗剂ifenprodil对突触内mEPSCNMDA的影响
10 μmol/L NR2B特异拮抗剂ifenprodil使培养1周的海马神经元mEPSCNMDA幅度平均减小 (80.47 ± 6.12)％（n＝6），仅阻断了(12.27 ± 2.02)％ 培养2周神经元的mEPSCNMDA（n＝7），二者差别有统计学意义（t=-2.360, P=0.030）。
3 讨 论
3.1 突触内NMDAR的发育变化
我们发现10 μmol/L ifenprodil阻断了(80.47±6.12)％培养1周海马神经元的mEPSCNMDA，与阻断重组NR1/NR2B的效果一致。Ifenprodil对NR1/NR2B的特异性高，对重组的NR1/NR2B的阻断效应比重组的NR1/NR2A高400倍，因此ifenprodil可作为检测NR1/NR2B是否存在及占多大比例的药物[6]。但即便如此，ifenprodil也只能阻断80％左右的NR1/NR2B的反应。由于海马和皮层神经元NR2主要是NR2A和NR2B[2-4]，因此我们的结果提示培养1周神经元突触内的NMDAR主要为NR1/NR2B。10 μmol/L ifenprodil只阻断了培养2周神经元mEPSCNMDA的（12.27 ± 2.02）％，提示此时突触内NMDAR主要为NR1/NR2A。我们的结果与NR2亚单位的表达存在发育变化一致。胚胎晚期及出生后海马主要表达NR2B，NR2D有少量表达。出生1周后才出现NR2A的表达。但出生2周后，NR2A的表达超过NR2B的表达，占主要地位。以前的研究结果提示在突触内同一受体复合物存在异源的NR1/NR2A/NR2B[4,7]。由于NR1/NR2A/NR2B对ifenprodil的敏感性也很低[4,6]，因此我们推测培养2周的海马神经元突触内可能存在NR1/NR2A异二聚体和NR1/NR2A/NR2B异三聚体。我们的结果与以前的报道略有差异。Tovar[4]和Thomas[5]等认为培养2周的海马神经元突触内也主要为NR1/NR2A，但他们发现ifenprodil仍可阻断40％左右的NMDAR介导的EPSC，因此推测突触内仍存在一部分NR1/NR2B。存在差异的原因可能是采用的标本和记录的方式不同。他们采用低密度法培养细胞，记录的是自身突触。这种模型虽然可用来记录突触内和突触外电流，但在生物体中毕竟不可能只存在自身突触。此外，他们记录的是诱发的EPSC，这种方法在激活突触内NMDAR的同时也可能激活一部分突触外NMDAR，而突触外NMDAR主要为NR1/NR2B，因此诱发的EPSCNMDA对ifenprodil的敏感性较高。而我们记录自发的mEPSC，完全是由突触内受体介导的，并且更体现生理状态的突触活动。
3.2 突触内NMDAR发育变化的可能机制
以前人们发现突触的形成首先需要NR2B，是一种非活动依赖性的方式。随着活动发生，当配体与突触处的NR1/NR2B结合，这些受体会发生内吞，被NR1/NR2A取代。NMDAR位于兴奋性突触的突触后膜，由NR2亚单位C-末端PDZ结合区与突触后膜一些脚手架蛋白如PSD-95家族结合形成突触后致密斑（postsynaptic density, PSD）[8]。C-末端作为调节蛋白或附属蛋白的靶区，在促进受体组装、分类或靶向中起作用，并参与不同通道的形成及功能调节，是NMDAR定位在突触处的关键。NR2A和NR2B的胞内C-末端区域不同，分别是627和644个氨基酸，因此它们与不同的PSD蛋白有不同的亲和力，NR2A更易与PSD-95结合，而NR2B更易与SAP-102结合。PSD-95与NR2A结合后能增加NR2A在突触处的表达并减少突触内NR2B的表达[9]。发育过程中最初的突触活动可导致NR2A与PSD-95的结合迅速增加[10]，并且PSD-95的表达也随发育增加[11]，因此可促进突触处NR2A的增加及NR2B的减少。此外NR2A和NR2B的C末端有不同内吞模块，这些内吞模块与笼形蛋白适配器有不同亲和力[12]。成年突触处NR2B的内吞多于NR2A，因而NR2A在突触的表达更稳定。由于突触内和突触外NMDAR之间会发生侧移[13]，我们推测发育后期突触内NR2B被NR2A取代还可能是NR2B侧向移动到突触外的结果。我们确实发现培养2周海马神经元突触外NMDAR介导的单通道电流的幅度、开放概率都比培养1周神经元增大，对ifenprodil的敏感性也比1周神经元高（待发表）。
3.3 突触内NMDAR发育变化的意义
由于NMDAR是诱导依赖活动的突触修饰的关键[14]，并且NR1/NR2A失活快[15]，可限制通道开放时程，因此突触处NMDAR亚单位的发育变化可能在突触可塑性和对兴奋毒的敏感性方面起重要作用。
【】
HARDINGHAM G E, FUKUNAGA Y, BADING H. Extrasynaptic NMDARs oppose synaptic NMDARs by triggering CREB shut-off and cell death pathways [J]. Nat Neurosci, 2002, 5(5): 405-414.
LIU L, WONG T P, POZZA M F, et al. Role of NMDA receptor subtypes in governing the direction of hippocampal synaptic plasticity [J]. Science, 2004, 304(5673): 1021-1024.
MASSEY P V, JOHNSON B E, MOULT P R, et al. Differential roles of NR2A and NR2B?鄄containing NMDA receptors in cortical long-term potentiation and long-term depression [J]. J Neurosci, 2004, 24(36): 7821-7828.
TOVAR K R, WESTBROOK G L. The incorporation of NMDA receptors with a distinct subunit composition at nascent hippocampal synapses in vitro [J]. J Neurosci, 1999, 19(10): 4180-4188.
THOMAS C G, MILLER A J, WESTBROOK G L. Synaptic and extrasynaptic NMDA receptor NR2 subunits in cultured hippocampal neurons [J]. J Neuro?physiol, 2006, 95(3): 1727-1734.
WILLIAMS K. Ifenprodil discriminates subtypes of the N-methyl-D-aspartate receptor: selectivity and mecha?鄄nisms at recombinant heteromeric receptors [J]. Mol Pharmacol, 1993, 44(4): 851-859.
LUO J, WANG Y, YASUADA RP, et al. The majority of N-Methyl-D-Aspartate receptor complexes in adult rat cerebral cortex contain at least three different subunits (NR1/NR2A/NR2B) [J]. Mol Pharmacol, 1997, 51(1): 79-86.
SHENG M. The postsynaptic NMDA-receptor-PSD-95 signaling complex in excitatory synapses of the brain [J]. J Cell Sci, 2001, 114（pt 7）: 1251.
LOSI G, PRYBYLOWSKI K, FU Z, et al. PSD-95 regulates NMDA receptors in developing cerebellar granule neurons of the rat [J]. J Physiol, 2003, 548（pt 1）: 21-29.
SANS N, PETRALIA R S, WANG Y X, et al. A developmental change in NMDA receptor-associated proteins at hippocampal synapses [J]. J Neurosci, 2000, 20(3): 1260-1271.
YOSHII A, SHENG M H, CONSTANTINE-PATON M. Eye opening induces a rapid dendritiec localization of PSD-95 in central visual neurons [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(3): 1334-1339.
ROCHE K W, STANDLEY S, MCCALLUM J, et al. Molecular determinants of NMDA receptor internalization [J]. Nat Neurosci , 2001, 4(8): 794-802.
TOVAR K R, WESTBROOK G L. Mobile NMDA receptors at hippocampal synapses [J]. Neuron, 2002, 34(2): 255-264.
MALENKA R C, NICOLL R A. Long-term potentiation-a decade of progress? [J]. Science, 1999, 285(5435): 18701-18704.
MONYER H, SPRENGEL R, SCHOEPFER R, et al. Heteromeric NMDA receptors: molecular and functional distinction of subtypes [J]. Science, 1992, 256(5060): 1217-1221.
