血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后缝隙连接蛋白Cx43表达的变化
作者：杨军, 伍卫 梁蔚文, 王景峰, 潘秋辉, 方昶 黄至斌
【摘要】 【目的】 研究血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后连接蛋白43 (Cx43) 表达的变化及与细胞周期分布的关系。【方法】 分离培养大鼠心肌细胞,用血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大,72h后用RT-PCR和免疫荧光方法观察心肌细胞Cx43基因和蛋白表达, 用流式细胞仪测定法观察心肌细胞周期分布变化以及Cx43 表达量的关系。【结果】 血管紧张素Ⅱ处理后的心肌细胞表现细胞肥大且细胞活力增强，S 期、G2-M 期细胞百分比增加, 细胞内G2-M（二倍体）DNA含量降低，Cx43 蛋白表达低于对照组，Cx43 mRNA 表达水平也较对照组明显下调，Cx43 蛋白表达下调与细胞周期分布的改变相关。【结论】 血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后Cx43基因表达明显下调，导致Cx43蛋白表达亦出现下调，这一改变可能与心肌肥大过程中的细胞周期变化有关, 提示血管紧张素Ⅱ可能通过调控Cx43基因的表达而参与缝隙连接重构过程，而Cx43表达的变化可能与心肌肥大的机制有关。
【关键词】 血管紧张素Ⅱ； 心肌细胞肥大； 连接蛋白43； 缝隙连接； 细胞周期
[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(3):292-296] 心肌肥大是多种心血管疾病过程中的一个共同的病理过程，尽管心肌肥大曾被认为是心脏的一种适应性代偿反应， 但目前已认识到心肌肥大(myocardial hypertrophy) 是心血管疾病中的一种独立危险因素，心肌肥大本身即明显增加心血管病死亡率，而其内在机制认为与心肌肥大所致的电生理重构有关。目前发现细胞间缝隙连接的改变在心肌电生理重构起着重要作用。缝隙连接蛋白43 (connexin 43, Cx43) 是心肌细胞间隙连接的主要蛋白成分,该连接构成相邻细胞间亲水管道，对于细胞间信息传导,细胞的生长、分化及维持心肌节律性同步收缩有重要意义[1] 。有学者发现心肌肥大后的心肌Cx43 表达下降[2-4] ,但也有学者报道实验性高血压引起心肌肥大时其心肌Cx43表达无改变[5]或Cx43 表达增加[8]；而对于心肌肥大过程中Cx43改变的机制以及血管紧张素Ⅱ对缝隙连接蛋白重构的影响至今还鲜见报道，我们通过本实验观察了血管紧张素Ⅱ对心肌Cx43基因和蛋白表达及细胞周期影响,探讨心肌肥大过程中Cx43的变化及血管紧张素Ⅱ对缝隙连接蛋白重构的可能作用和机制。
1 材料与方法
1. 1 主要试剂和仪器
DMEM-F12培养基(Gibco) ；胎牛血清(BCS, 四季青公司)；血管紧张素Ⅱ (Sigma) ；5-溴脱氧嘧啶核苷(Sigma)；胰蛋白酶(Difco)；兔抗大鼠Cx43多抗(博士德公司)； FITC－羊抗兔IgG(博士德公司); 缬沙坦原药(北京诺华制药有限公司)；RNA逆转录试剂盒 (TOYOBO公司)；Trizol RNA提取液( MRC公司)；PCR 引物(北京赛百特公司合成)；PCR 主要试剂购自TAKARA公司；其它常用生化试剂均为国产分析纯。流式细胞检测仪(Epics Altra型,美国Beckman Counter公司)。
1.2 心肌细胞培养及分组
每次取1～3 d龄的Wistar大鼠20只，按改良的simpson法进行心肌细胞培养。主要过程为：将大鼠心室肌用0.25% 胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心弃上清后，加入含20% 胎牛血清的DMEM-F12培养液重新悬浮细胞。将细胞悬液转移至75 cm2 培养瓶中,置于5% CO2 培养箱内37 ℃差速贴壁90 min，再取未贴壁细胞均匀地接种96孔及6孔培养板上继续培养。仅在培养第一天中加0.1 mmol/L的5-溴脱氧嘧啶核苷抑制非心肌细胞生长，24 h后换无5-溴脱氧嘧啶核苷的培养基[8]。约3 d后, 心肌细胞成簇生长并出现搏动。1周左右, 细胞密集紧密接触，达到同步收缩，此时培养心肌细胞可用于实验。实验分为两组：血管紧张素Ⅱ组：每天所换培养液中加血管紧张素Ⅱ（以无血清培养液溶解）使终浓度为1.0×10-6 mol/L，正常对照组(control)：培养液中加等量无血清培养液。处理72 h后在显微镜下观察细胞形态，细胞计数，同时分别取两组细胞作MTT、细胞周期检测、免疫荧光和RT-PCR检测。
1.3 四氮甲唑蓝(MTT) 法测定对心肌细胞增殖的影响
采用MTT法检测细胞的增殖活性。取原代培养心肌细胞接种于96 孔平底细胞培养板上，每组10个孔，培养24 h，然后换含10 mL/L血清的培养液，24 h后,实验组换用添加含浓度为1.0×10-6 mol/L血管紧张素Ⅱ的无血清的培养液200 μL，对照组换含相同浓度DMSO的无血清的培养液200 μL，72 h后,加入MTT(5 μg/L) 20 μL/孔继续培养4 h 。加入二甲基亚砜原液200 μL/孔，酶联免疫检测仪下选择波长490 nm测定酶联免疫吸附A 值。
1. 4 流式细胞仪测定细胞周期
取血管紧张素Ⅱ（终浓度1.0×10-6 mol/L）处理72 h后的细胞及对照细胞制成单细胞悬液，以750 mL/L酒精固定细胞后，加入200 μL PI(0.1×10-3 mg/L) ,4℃染色1 h后上机检测。流式细胞检测仪检测。经数据获取软件分析，重复4次。
1.5 免疫荧光检测Cx43 表达
细胞以1.0×105/mL的密度接种于置小盖玻片的24孔培养板, 取血管紧张素Ⅱ处理72 h后，取出盖玻片，PBS 冲洗，950 mL/L乙醇固定，1％TritonX-100 室温孵育20 min。滴加一抗Cx43, 4 ℃过夜后滴加Cy3-羊抗兔IgG(1∶100) ，荧光显微镜下观察并进行照相分析。
1.6 逆转录聚合酶链反应(RT－PCR)
参照Genebank 资料设计并合成引物[6]。引物序列为: Cx43, F: 5′-TTGTTTCTGTCACCAGTAAC-3′, R: 5′-GATGAGGAAGGAAGAGA-AGC-3′, 扩增序列长度为588bp;β-actin，F: 5′-CACGGCATT GTAACCAACTG-3′,5′-TCTCAGCTGTGGTGGTGA AG-3′,扩增长度为400 bp。取处理72 h后的细胞按TRIZOL试剂盒所示方法提取总RNA,取6 μL RNA 逆转录成cDNA。PCR反应条件：94 ℃变性2 min后，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s 顺序循环35次,最后72 ℃延伸5 min。电泳及图像扫描及定量分析。测目的基因与β-actin的RT-PCR产物电泳带的OD值比。
1.7 统计学分析
所有数据均以ｘ±ｓ表示,使用SPSS 11.0及Excel统计软件分析, 两组间比较用独立样本t检验或配对t检验, 变量间的相关分析采用双变量相关性分析，以P < 0.05 为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 镜下心肌细胞观察结果
镜下观察可见在加用血管紧张素Ⅱ刺激后，心肌细胞较正常对照组表现明显肥大。细胞计数显示正常对照组和血管紧张素Ⅱ组分别为5.66 ± 0.57和5.88 ± 0.86（105/mL）。血管紧张素Ⅱ组细胞计数表现出增加趋势，但两组间差别没有统计学意义 (n=4, P > 0.05) 。
2.2 血管紧张素Ⅱ对细胞增殖的影响
结果显示，正常对照组A 值为0.190 ± 0.016，血管紧张素Ⅱ组A 值为0.214 ± 0.024，提示血管紧张素Ⅱ可增强心肌细胞活力(n=4, P < 0.01) 。
2.3 血管紧张素Ⅱ对细胞周期的影响
血管紧张素Ⅱ组中S 期、G2-M 期细胞百分比增加(n=4,P < 0. 05)，G0-G1 期细胞百分比与正常对照组相比有减少趋势，但无统计学差异(n=4,P > 0. 05)。血管紧张素Ⅱ刺激心肌细胞72 h，细胞内G2-M（二倍体）DNA含量低于对照组（P < 0.05），G0-G1（单倍体）DNA含量与对照组比较未显示出统计学差异(n=4, P > 0. 05)。结果提示培养心肌细胞在血管紧张素Ⅱ作用下出现心肌肥大(表1)。
2.4 血管紧张素Ⅱ对Cx43蛋白表达的影响
在培养心肌细胞Cx43呈明显阳性反应，较强红色荧光表达在细胞膜及胞浆中(图1) 。血管紧张素Ⅱ组其反应明显弱于对照组(图2)，单位面积荧光计数结果（荧光阳性细胞数/mm2 ）正常对照组和血管紧张素Ⅱ组分别为67.15 ± 11.87 和41.88 ± 4.87，显示两者差异有显著性(n=4, P< 0.05) 。
2.5 血管紧张素Ⅱ对Cx43mRNA表达的影响
血管紧张素Ⅱ组和对照组Cx43及β-actin的mRNA 表达水平电泳分析见图3，各基因的RT-PCR产物电泳带的位置与理论值相符，两组OD值比分别为0.671 ± 0.123和0.414 ± 0.116。对照组和处理组β-actin的mRNA 表达水平相似，而与正常对照组相比，AngⅡ可显著减少Cx43mRNA 的表达(n=4, P < 0.01)。
2.6 Cx43表达与细胞周期特征变化的相关性
对血管紧张素Ⅱ处理后心肌细胞Cx43表达与细胞周期分布变化进行双变量相关性分析后发现：血管紧张素Ⅱ处理后Cx43蛋白表达的变化，即免疫荧光检测中单位面积荧光阳性细胞计数，与Cx43 mRNA 表达水平的变化相关（r=0.995, P < 0.01），而前者与S 期细胞百分比变化呈负相关(r=-0.912, P< 0.05)，与细胞内G2-M（二倍体）DNA含量呈正相关（r=0.896, P< 0.05）；但与G2-M 期细胞百分比，G0-G1（单倍体）DNA含量的变化以及MTT测得的吸附A 值变化未表现出明显相关关系（P >0.05）。结果提示：Cx43表达的变化与心肌细胞的细胞周期改变可能相关。
3 讨 论
心肌肥大作为心血管疾病中的一种独立危险因素明显增加心血管病死亡率，其机制与心肌肥大所致的电生理重构有关。心肌电生理重构包括细胞膜离子通道的变化和/或细胞间缝隙连接的改变，在某些情况下后者显得更为重要。细胞缝隙连接(Gap Junction,GJ)是心肌细胞间唯一具有电连接作用的细胞间连接形式，相邻细胞间通过GJ进行着信息和能量物质的交换，并对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程也起着重要的调控作用[1]。在连接蛋白这个多基因大家族中，其中Cx43是心肌最主要的连接蛋白，尤其是心室肌细胞间电流的主要导体。
本实验通过有效致心肌细胞肥大剂量的血管紧张素Ⅱ处理培养心肌细胞72 h后，心肌细胞出现明显肥大，同时更多细胞进入S期，心肌细胞的细胞周期分布特征也提示心肌细胞在经血管紧张素Ⅱ处理后处于肥大状态。而在免疫荧光检测中可观察到肥大心肌细胞的Cx43蛋白的表达出现下调。这一结果与国内外多数学者从在体实验中观察到的结果一致 [2-4,7]。而作为缝隙连接的主要结构蛋白，心肌Cx43表达下调可导致心肌兴奋性、传导性改变，故更易发生心律失常，这也可能是心肌肥大为何成为心血管疾病的一种独立危险因素的重要原因。实验中同样也看到血管紧张素Ⅱ处理后的心肌细胞的Cx43mRNA表达水平也出现明显下调，提示Cx43蛋白表达下调与基因水平的调控有关，血管紧张素Ⅱ可能通过基因水平的调控参与了肥大心肌的缝隙连接蛋白的重构过程。
本实验中发现血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后Cx43基因和蛋白表达出现明显下调，而在心肌肥大过程中Cx43的变化可能并非如此简单。如有学者就发现慢性压力超负荷引起的肥大心肌左心室Cx43 在每个心肌表达及分布形式与正常无显著差别[2,7]。而Dodge[8]用0.1 μmol/L的血管紧张素Ⅱ作用于培养乳鼠心室肌6 h 和24 h 后，发现Cx43蛋白的表达增加。Formigli等[9]证实增加猪心脏的容量负荷可以引起Cx43增加,并伴有心室肥厚。Peters等在对5例主动脉瓣狭窄所致左室肥厚的左室心肌活检标本的研究中, 发现无缺血的肥大心肌细胞每单位体积的缝隙连接中Cx43含量减少40%[2]。同时国内也有学者用去甲肾上腺素或苯肾上腺素诱导心肌肥大，作用48 h后发现培养大鼠心肌细胞中Cx43蛋白表达减少，推测可能与心肌细胞进入S期有关 [11]。因此在心肌肥大过程中Cx43的变化可能是十分复杂的，其演变目前并不是十分明确[12]，目前国内外学者对心肌肥大时Cx43变化观察的结果并不尽相同，其原因可能与观察的动物模型和动物种属不同有关，而心肌细胞Cx43表达本身的变化也很有可能具有与心肌肥大进程相关的时相特征，正如有学者通过对心室机械负荷增加引起心肌肥大和心力衰竭的模型分析所发现的；在早期阶段，Cx43表达上调；而在心力衰竭晚期阶段, 则心肌传导速度及Cx43表达下调[13]。
与此同时，虽已有学者证实：Cx43参与细胞生长的调节,并与横纹肌肉瘤分化以及平滑肌细胞的表型改变有关[10,14] ，而在心肌肥大过程中的作用目前仍不确定。实验中我们不仅发现血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后Cx43基因和蛋白的表达均出现明显下调，而且我们还发现Cx43蛋白表达的变化与细胞周期分布变化相关：提示血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后Cx43蛋白表达的变化可能是心肌肥大过程中的一个重要特征，心肌细胞肥大后出现以Cx43表达水平下调为主要特征的缝隙连接蛋白重构，而这种重构已发现与心律失常的发生机制密切相关。但Cx43变化在心肌肥大和心肌重塑中的时相特征和具体意义，以及与胞内信号转导的关系,仍有待进一步研究。
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CRUCIANI V, MIKALSEN S O. Connexins, gap junction intercellular communication and kinases [J] . Biol Cell, 2002, 94（7-8）: 433-443.
ITOH M, TAKEISHI Y, NAKADA, et al. Long-term treatment with angiotensin Ⅱ type 1 receptor antagonist, CV-11974, restores beta-catenin mRNA expression in volume-overloaded rabbit hearts [J].Heart Vessels, 2002, 17(1): 36-41.
EMDAD L, UZZAMAN M, TAKAGISHI Y, et al. Gap junction remodeling in hypertrophied left ventricles of aortic-banded rats: prevention by angiotensin Ⅱ type 1 receptor blockade[J]. J Mol Cell Cardiol, 2001, 33(2): 219-231.
UZZAMAN M, HONJO H, TAKAGISHI Y, et al. Remodeling of gap junctional coupling in hypertrophied right ventricles of rats with monocrotaline induced pulmonary hypertension [J]. Circ Res, 2000, 86 (8): 871-878.
闫纯英,林吉进,李玉光,等. 心肌肥大时间隙连接分布的改变及其对传导特性的影响 [J]. 分子心脏病杂志, 2003,2(3):7-10.
GUO R, LIU L, BARAJAS L. RT-PCR study of the distribution of connexin 43 mRNA in the glomerulus and renal tubular segments[J]. Am J Physiol, 1998, 275: R439-R447.
KOSTIN S, DAMMER S, HEIN S, et al. Connexin43 expression and distribution in compensated and decompensated cardiac hypertrophy in patients with aortic stenosis [J]. Cardiovasc Res, 2004, 62(2):426-436.
DODGE S M, BEARDSLEE M A, DARROW B J, et al. Effects of angiotensinⅡ on expression of the gap junction channel protein Connexin43 in neonatal rat ventricularmyocytes [J]. J Am Coll Cardiol, 1998, 32(4):800-807.
FORMIGLI L, IBBA-MANNESCHI L, PERNA A M, et al. Altered connexin 43 expression during myocardial adaptation to acute and chronic volume overloading [J]. Histol Histopathol, 2003, 18 (2):359-369.
林仲翔,张志谦,韩亚玲,等.连接蛋白基因表达与横纹肌肉瘤分化关系研究 [J] .中国(B辑),1994,6(24): 623-628.
张 骅,楼定安,单芷茵,等. 连接蛋白43在培养心肌肥大时的表达及其意义 [J]. 中华病杂志, 1998, 27, (6),436-438.
SAFFITZ J E, KLEBER A G. Effects of mechanical forces and mediators of hypertrophy on remodeling of gap junctions in the heart [J]. Circ Res, 2004, 94(5): 585-591.
ZHUANG J, YAMADA K A, SAFFITZ J E, et al. Pulsatile stretch remodels cell-to-cell communication in cultured myocytes [J]. Circ Res, 2000, 87 (4) : 316- 322.
RAMA A, MATSUSHITA T, CHAROLIDI N, et al. Up-regulation of connexin43 correlates with increased synthetic activity and enhanced contractile differentiation in TGF-beta-treated human aortic smooth muscle cells [J]. Eur J Cell Biol, 2006, 85(5): 375-386.
