神经元型一氧化氮合酶在快速衰老小鼠海马中的增龄性改变
【摘要】 【目的】 通过观察快速衰老小鼠(SAM)在衰老过程中海马中nNOS的分布和表达变化，探讨NO/nNOS在中枢神经系统衰老中的作用。【方法】采用雄性快速衰老亚系8小鼠(SAMP8)及抗快速衰老亚系1小鼠(SAMR1)为研究对象，其中SAMP8为实验组，SAMR1为对照组，每组动物再分为青年组（2月龄）和老年组（10月龄）两组，每个年龄组随机分配6只动物。用免疫组织化学法标记SAM海马中nNOS神经元，观察海马CA1，CA2和CA3区nNOS神经元的形态和分布，并计数nNOS神经元的数量；用RT-PCR法检测海马中nNOS mRNA表达水平（用平均灰度值表示）。【结果】老龄SAMP8海马中阳性神经元的形态与其它组比较无明显差别，但CA1和CA2区阳性神经元密度明显减低，CA3区阳性神经元密度无明显改变。SAMP8老年组与青年组相比，海马CA1和CA2区nNOS阳性细胞的数量显著减少(73±14 vs 144±38, P< 0.01; 71±30 vs 126±39, P< 0.05)，CA3区阳性神经元数量无显著差别；SAMP8与SAMR1比较，青年组海马nNOS阳性细胞的数量无显著差别，老年组海马CA1和CA2区阳性细胞的数量显著减少(73±14 vs 139±24, P< 0.01; 71±30 vs 120±37, P< 0.05)。SAMP8老年组海马nNOS mRNA水平明显低于青年组(0.43±0.17 vs 0.92±0.15, P< 0.01)，且低于相应月龄SAMR1(0.43±0.17 vs 0.86±0.13, P< 0.01)。【结论】海马中nNOS催化产生不足量NO可能加速SAMP8衰老，致使学习记忆能力下降，为通过调节NO产量来延缓衰老及衰老相关学习记忆能力下降提供了理论依据。
【关键词】 神经元型一氧化氮合酶； 一氧化氮； 衰老； 快速衰老小鼠； 海马
一氧化氮(nitric oxide, NO)在中枢神经系统中是一种兼具细胞间、细胞内信使和神经递质作用的信息分子，在机体内发挥着极其重要的生理和病理作用[1]。随着对NO不断深入的研究，发现其与中枢神经系统衰老关系密切，已成为神经病学和神经生物学研究的热点之一[2]。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)是NO生物合成的关键酶[3]，不同的NOS催化合成的NO在不同的组织细胞中发挥着不同的生物学效应，神经元型NOS(neuronal NOS, nNOS)产生的NO在学习记忆机制中起重要作用[4]。海马是与学习记忆功能最密切的脑区之一[5]。由于NO的半衰期很短，高度活跃，极不稳定，直接检测尚存在技术上的困难，因此多采用检测NOS的间接方法来反映组织细胞中的NO含量。目前，该领域的研究多采用正常衰老的动物为研究对象，而且研究结果不一致。快速衰老亚系8小鼠(senescence accelerated mouse/prone 8, SAMP8) [6]是目前研究衰老及衰老相关学习记忆功能障碍的良好的哺乳类动物模型，但是，有关nNOS在SAMP8海马中增龄性改变的研究，在国内外尚未见报道。本实验通过观察SAMP8在衰老过程中海马中nNOS的分布和表达变化，探讨NO/nNOS在中枢神经系统衰老以及衰老相关学习记忆障碍中的作用及意义。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
采用雄性SAMP8和抗快速衰老亚系1小鼠 (senescence accelerated mouse/resistance 1，SAMR1)为研究对象(由香港中文大学实验动物中心提供)，其中SAMP8为实验组，SAMR1为对照组，每组动物再分为青年组 (2月龄)和老年组(10月龄)两组，每个年龄组随机分配6只动物。饲养环境：动物饲养于无特异病源菌房间，昼夜循环周期为12 h∶12 h（6:00开灯，18:00关灯），自由饮水饮食，温度(20±1)℃。
1.2 实验试剂与器材
nNOS多克隆抗体（一抗）购自Santa Cruz公司；驴抗兔FITC荧光抗体，激发光波长为488 nm（二抗）购自Molecular probes公司；Trizol、cDNA合成试剂盒、PCR试剂盒、10×上样缓冲液、100 bp DNA ladder等试剂均购自Invitrogen公司；氯仿、异丙醇、乙醇等均购自Sigma公司。As620E恒温冷冻切片机由美国Shandon公司制造；MRC1024激光共聚焦显微镜和mini-sub cell GT电泳仪由BIO-RAD公司制造；Axiophot2荧光显微镜由Zeiss公司制造；Biophotometer分光光度仪由Eppendorf公司制造；GeneAmp2400PCR仪由美国Perkin Elmer公司制造；凝胶成像系统及Fluorchem 1.02a分析软件由美国ALPHA Innotech公司制造。
1.3 免疫组织化学法检测nNOS在SAMP8和SAMR1海马中的分布和表达
SAM经腹腔注射70 g/L水合氯醛（350 mg/kg）麻醉后，再经升主动脉快速灌注8.5 g/L生理盐水约50 mL，继之灌注40 g/L多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1 mol/L, pH=7.4)约200 mL。将脑取出，后固定于40 g/L多聚甲醛磷酸缓冲液中，4 ℃，4 h，然后将组织移入含100 g/L蔗糖0.1 mol/L磷酸缓冲液1 h (pH=7.4, 4℃)，再入250 g/L蔗糖磷酸缓冲液中约24~48 h，至组织下沉， OCT复合物包埋，放入液氮冷却的异戊烷中冷冻。冷冻包块在海马部位作冰冻连续冠状切片，核团定位参照George Paxinos等的图谱[7]。切片厚40 ?滋m，间隔3片取2片，用免疫荧光标记法进行漂染，步骤如下：(1)孵育切片于包含3 mL/L TritonX-100和50 mL/L正常驴血清的PBS缓冲液中，30 min，去除上述阻断液（不要漂洗）；(2)孵育切片于一抗溶液中（稀释度为1 ∶ 500）室温下过夜；(3)孵育切片于二抗溶液中（稀释度为1∶600）室温下2 h；(4)以上各步骤间均用0.01 mol/L的PBS缓冲液漂洗3次，每次5 min；(5)常规裱片，封片；(6)在普通荧光显微镜下观察（激发光为470 nm，释放光为520 nm，黄绿色荧光），人工计数阳性细胞数，激光共聚焦显微镜拍照，所有分析由一个对实验分组不知情者完成。阴性对照用PBS缓冲液代替一抗。
1.4 RT-PCR法检测海马nNOS mRNA的水平
小鼠经颈椎脱位处死后，立即打开颅骨充分暴露脑部，将两侧海马完整取出，冷冻于-80 ℃冰箱中。按Trizol法提取总mRNA，然后逆转录合成cDNA：即50 ?滋mol/L oligo(dT)12~18 1.0 ?滋L，10 mmol/L dNTP mix 1.0 ?滋L，RNA 2.0 ?滋g，总体积13.0 ?滋L，将此溶液在65 ℃孵育5 min后立即置冰上冷却至少1 min，然后分别加入以下溶液：5 × first strand buffer 4.0 ?滋L，0.1 mol/L DTT 1.0 ?滋L，RNA酶抑制剂1.0 ?滋L，SuperScriptⅢ逆转录酶（200 U/?滋L）1.0 ?滋L，将以上成分混匀，50 ℃孵育60 min，然后70 ℃加热15 min终止反应。最后进行PCR反应：10 × PCR buffer 2.5 ?滋L，50 mmol/L MgCl 0.75 ?滋L，10 mmol/L dNTP 0.5 ?滋L，待测基因的上下游引物均为0.5 ?滋L，DEPC H2O 19.05 ?滋L，cDNA 1.0 ?滋L，Taq DNA聚合酶(5 U/?滋L) 0.2 ?滋L，总体积25.0 ?滋L。反应条件：94 ℃，5 min，然后94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环,全部周期结束后于72 ℃延伸5 min。每个样本重复至少2次。PCR反应后，取10 ?滋L PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳(含EB，终浓度0.5 ?滋g/mL)30 min,电压100 V，用凝胶成像系统拍照观察，用Fluorchem 1.02a软件对条带的灰度进行分析。将实验组和对照组条带的平均灰度值与相应的β-actin条带的平均灰度值的比值进行比较。从基因库（）中查出小鼠nNOS及β-actin的cDNA全序列，用Primer3引物设计软件设计其特异性PCR引物，由Invitrogen公司合成。nNOS上游引物5′-CCA GCT CTT CCC TCT AGC-3′，下游引物 5′-CTT TGT TGG TGG CGT ACT-3′，产物大小为302 bp。
1.5 统计学分析
数据用均数±标准(ｘ±ｓ)差表示，采用方差分析进行统计比较，P< 0.05被认为差异有统计学意义，应用SPSS11.0软件完成。
2 结 果
2.1 海马内nNOS阳性神经元的形态和分布变化
多形细胞层和分子层有少量阳性神经元散在分布，锥体细胞层多数神经元呈阳性标记。阳性细胞大小不等，着色深浅不一，大多为卵圆形或圆形。老年组SAMP8的CA1和CA2区阳性神经元的形态与其它组比较无明显差别，但分布密度和强度明显减低（图1、2，见封2）；CA3区阳性神经元的形态和分布与其它组比较均无明显差别。
2.2 海马内nNOS免疫阳性神经元的数目变化
SAMP8老年组（10月龄）与青年组（2月龄）相比，海马CA1区阳性细胞的数量减少非常显著，海马CA2区阳性细胞的数量显著减少；CA3区阳性神经元数量无显著差别；SAMP8与SAMR1比较，青年组海马CA1和CA2区阳性细胞的数量无显著差别，老年组阳性细胞的数量显著减少，CA3区两组阳性细胞的数量均无显著差别(表1)。
2.3 SAMP8海马中nNOS mRNA表达水平
老年SAMP8海马nNOS mRNA水平（用平均灰度值表示）明显低于青年组SAMP8，且低于相应月龄对照组SAMR1（图3，表2）。
3 讨 论
3.1 目前对于衰老动物模型的研究现状
目前在衰老的研究中，多以正常老化动物为模型，其缺点不仅有饲养时间长、价格昂贵等不足，而且正常衰老的动物多不伴有典型的病理特征，因此作为研究衰老相关性疾病的模型具有一定的局限性。SAM是目前研究快速衰老的良好的哺乳类动物模型[6]，分为SAMP及SAMR亚系，每一亚系又根据病理改变不同分为不同表现型，SAMP8[8]主要以学习记忆功能呈增龄性加速衰退、中枢神经系统如皮层、海马等部位发生与人类相似的病改变为主。此外，小鼠遗传信息非常丰富，与人类遗传学特征非常相似。SAMP8在2月龄就开始出现学习记忆功能衰退，并随增龄而加重，表现为空间学习记忆能力下降。因此，SAMP8为探讨中枢神经系统衰老及衰老相关学习记忆功能障碍的发生机制提供了良好的动物模型。有关nNOS在SAMP8海马中增龄性改变的研究，在国内外尚未见报道。
3.2 本实验nNOS在SAMP8和SAMR1海马中增龄性改变及相关研究结果
本实验运用免疫组化法研究了SAMP8海马nNOS阳性神经元的分布及其变化，发现这种阳性细胞在海马各亚区均有分布；在CA1和CA2区，SAMP8老年组的nNOS阳性神经元数量较青年组SAMP8明显减少，而且少于相应年龄段的对照组。在CA3区，SAMP8 nNOS阳性神经元数量不随月龄增加发生改变，与青年组比较亦无明显差别。RT-PCR结果发现SAMP8老年组海马中的nNOS mRNA水平较青年组SAMP8明显减少，而且低于相应年龄段的对照组。以往研究发现：老年大鼠海马中nNOS阳性神经元数目、NOS活性、nNOS的表达水平较青年组大鼠减低[9-11]。尸检发现，Alzheimer病患者海马中nNOS阳性神经元数目和nNOS mRNA水平较正常衰老者明显减少[12]。本实验结果与这些以往研究结果基本一致。
3.3 NO/nNOS在中枢神经系统中的作用
NO在机体内是以L-精氨酸(L-Arg)为底物，在关键酶NOS的催化作用下合成的[3]。不同的NOS存在于机体的不同组织细胞中，催化合成的NO也发挥着不同的生物学效应，nNOS主要存在于中枢神经系统的大脑皮质、海马、小脑、下丘脑、脑干等部位的神经细胞内[13]。在正常生理情况下nNOS催化产生的NO作为中枢神经系统细胞间信使分子，在学习记忆机制中具有重要作用[4]。
目前认为，NO在中枢神经系统的主要作用包括[14-16]：①介导神经元对兴奋性氨基酸的反应；②作为一种逆向信息传递物质参与海马的长时程突触传递增强，以及小脑的长时程突触传递抑制过程，即记忆的长时程增强(LTP)和长时程抑制(LTD)；③神经毒性作用。
3.4 NO/nNOS对学习记忆功能的调节机制
NO对学习记忆的作用主要是以调节长时程效应而实现的。LTP是研究学习记忆机制的一种模式，被认为是记忆形成的神经基础。NO从突触后释放通过扩散作用于突触前膜，增加突触前谷氨酸的释放，使突触前突触后共同参与形成LTP[17]。
当NOS缺乏时，NO产生不足，即会影响LTP的形成，从而影响正常的学习记忆功能。海马是学习记忆的重要区域，在衰老过程中海马的功能和结构异常是学习记忆能力减低的最重要的原因[5]。NO/nNOS在学习记忆中的作用在功能和形态上已得到了较多的实验证明。给大鼠注射NOS抑制剂N-硝基精氨酸能阻断大鼠海马LTP的形成，同时使动物的空间学习记忆能力受损[18]；在学习记忆能力受损的大鼠海马内nNOS的数量显著减低[19]，以上说明衰老时海马内nNOS的改变与学习记忆功能密切相关。
本实验结果说明SAMP8在衰老过程中，海马的nNOS阳性神经元数目和mRNA表达水平减低，提示海马中NO产生不足，可能影响LTP的形成，致使学习记忆能力下降，从而可能参与SAMP8衰老时学习记忆能力下降的发生机制，为通过调节NO产量来延缓衰老及相关功能障碍提供了理论依据。但是，NO/nNOS在衰老时的具体变化机制仍不清楚，NO/nNOS的变化对衰老调节是否起作用及其作用程度方面，均有待进一步研究和探索。
（本文图1、2见封2 Figure 1 and 2 are on inside front cover)
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