人羊膜移植在眼科的应用

【关键词】  眼；羊膜；组织移植

　1995年Kim和Tseng［1］利用4℃100%甘油保存的人羊膜移植到破坏严重的兔眼表，获得了眼表重建术的成功。从此羊膜移植在眼科的应用领域被逐渐拓宽。

　　1  膜的解剖和组织学特点
    
　　人羊膜厚度为0.02～0.5mm，透明，有韧性，由一层厚的基底膜和无血管无神经和淋巴管的基质组成。由内到外分为5层：上皮细胞层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层。在基底膜面与绒毛膜之间有一潜在间隙，容易钝性分离。成熟期羊膜细胞表面及侧面有许多呈圆柱状、排列规则或不规则的微绒毛，其参与形成复杂扭曲的细胞间迷路管道系统。离体细胞实验和组织培养显示上皮细胞有合成、分泌和沉积基底膜、细胞外间质成分的能力。羊膜的基底膜是全身最厚的基底膜，为0.1μm，含有Ⅳ型胶原等多种胶原成分。基底膜下的致密层厚5～50μm不等，其主要功能是支持表面上皮生长［1，2］。因此羊膜细胞间的迷路管道系统有利于进行物质交换;丰富的胶原成分增强了其韧性;同时透明、无血管等组织特性使羊膜成为较为理想的眼表重建供体材料。

　　2  羊膜的生理和免疫学特征
    
　　动物实验和临床研究显示，羊膜是一种理想的支持上皮生长的物质，可延长其生命，维持其克隆。羊膜基底膜可以刺激结膜杯状细胞的分化、促进结膜干细胞分化为结膜上皮细胞、促进结膜上皮向角膜上皮转化，促进角膜缘干细胞增殖和角膜上皮细胞移行。羊膜基质中所含的一种成分，能抑制β转化生长因子(TGF-β)信号传递，抑制正常人角膜缘成纤维细胞的增殖和分化成为纤维细胞，减少瘢痕化，抑制新生血管形成。羊膜基质中不同形式的蛋白酶抑制因子，通过改变蛋白酶活性，清除炎症细胞，促使其迅速凋亡。在正常环境条件下保存人羊膜不表达人类白细胞抗原，因此不发生免疫排斥反应［1，2］。

　　3  羊膜移植眼表疾病的理论基础
    
　　deRott［3］最早将新鲜羊膜用于眼病的治疗，将新鲜活体羊膜连同绒毛膜一起移植到眼球表面，以治疗睑球粘连。Kim［1］用保存在4℃、100%甘油中的人羊膜，成功重建眼表层兔眼表面模型，提示角结膜上皮化、阻止宿主纤维血管物质内生到羊膜上。避免了活体植片发生排斥反应，证明保存人羊膜可推广于临床。羊膜可以促进正常结膜上皮化，防止广泛性结膜下纤维化瘢痕形成［4］。它有Ⅳ型胶原、整合素、板层体等［1］多种成分，可作为结膜上皮化的合适附着物。故此，羊膜移植可看作是“底物移植”［2］。羊膜移植的机制不同于其它类型的粘膜移植，它移植的是上皮活细胞，功能是作为眼表上皮的替代物质。羊膜移植中羊膜一旦被结膜上皮覆盖，就与结膜下组织不可区分。因此，具有显著改善外观的优点。羊膜抑制结膜下纤维化的机制并不十分清楚。由于羊膜在巩膜上形成了连续性胶原薄片，可能首先具有抑制结膜下纤维化的机械屏障功能［5］。羊膜可能促进正常上皮化，上皮细胞与基质细胞通过细胞因子的相互作用，可以抑制成纤维细胞形成。羊膜上皮细胞也可能产生某些生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和β-TGF。这些生长因子可以调控基质成纤维细胞、角膜上皮细胞的增殖和分化。Ma等［6］从分子生物学角度为羊膜移植的可行性提供了理论依据。研究表明羊膜能消除炎症及瘢痕化，重建正常上皮表型的一个重要原因是羊膜基质对成纤维细胞表达细胞因子的水平具有调节作用。它通过成纤维细胞移行上或移行进羊膜基质中，抑制了β1转化生长因子(TGF-β1)的表达，而TGF-β1是一种在伤口愈合过程中调整成纤维细胞活性的纤维生长原型细胞因子。这一观点已经被TGF-β1细胞因子转录表达及Northern核酸杂交实验所证实。当然，为证实这一观点的正确性，应继续研究其它细胞因子的表达方式。羊膜移植除了对眼表上皮和纤维组织的作用外，还具有其它几个适于眼表手术的特点：①羊膜获取比较容易，应用几乎不受限制，一个胎盘的羊膜可以制作20块3cm×3cm大小的组织块，在-80℃条件下最少可保存几个月；②在正常环境条件下保存的人羊膜不表达人类白细胞抗原，因此勿需担心手术后的免疫排斥反应；③由于羊膜具有抗病原微生物的功能，因此与口腔粘膜移植相比较，羊膜移植术后感染机会大大减少；④羊膜具有很强的抗粘附效果，对于眼表疾患的许多严重并发症，羊膜移植可有利于穹窿结膜囊的成形，防止睑球粘连的发生，促进弯月形泪液膜正常生理结构的出现［6］。

　　4  羊膜的制备和保存
    
　　从剖宫产或顺产无菌接生获得胎盘，供体(产妇)产前血清学检查，排除含有人类免疫缺陷性疾病(HIV)、乙肝病毒(HBV)和梅毒者；且产妇(供体)产道淋球菌、衣原体阴性。取出胎盘后即行灭菌处理。Prabhasawat［7］报道在层流罩下用50μg/ml青霉素、50μg/ml链霉素、100μg/ml新霉素、2.5μg/ml两性霉素B的Earle平衡盐溶液冲洗胎盘并获取羊膜。将羊膜平铺于硝酸纤维滤纸上并剪成3cm×4cm大小，储藏于-80℃含有Dulbecco改良的Eagle基质和甘油的无菌瓶中备用。Shimazaki［5］等报道，将羊膜与绒毛膜一起用含有地贝卡星(dibekacin)的PSS液处理后，于-80℃下保存。手术时解冻将羊膜与绒毛膜分离备用。我国陈家祺［8］提出湿房保存法，将新鲜羊膜制备后平铺于有盖的容器内，浸泡于DMEM培养液中，密封置于4℃冰箱保存12h内待用，此法用于新鲜羊膜移植。

　　5  手术应用范围
    
　　羊膜可用于多种眼表疾患的重建手术中［9］。①各种原因导致的角膜上皮缺损或溃疡包括外源性原因：感染、眼干燥症、眼表面化学烧伤及眼外伤等。内源性原因如神经营养因素神经麻痹、角膜软化等药物治疗无效时，用羊膜移植有明显的优越性或较好的疗效。对于角膜深层溃疡羊膜移植可用一层或多层覆盖溃疡表面治疗取得良好效果。②翼状胬肉切除术后常采用羊膜移植。毛羽翔等［10］报道应用羊膜移植治疗复发性翼状胬肉手术治愈率达到100％。③角膜缘干细胞缺乏伴有持续性角膜上皮缺损、角膜血管翳、白斑、溃疡溶解或穿孔等病例，角膜缘移植可以从根本上重建眼表。羊膜移植与角膜缘移植相结合，可以成功治疗角膜缘干细胞缺乏的眼表疾病，包括Stevens-Johnson综合征、眼瘢痕类天疱疮及眼部化学伤和热烧伤的病例。可先行角膜移植再行羊膜移植伴角膜缘移植。自体角膜缘植片可以培植于羊膜上用于眼表重建。④钟一声等［11］报道了羊膜在新西兰兔抗青光眼滤过性手术中的应用，刘永民等［12］报道了在青光眼兔模型羊膜移植治疗难治性青光眼方面的应用。⑤羊膜可治疗PRK术后角膜Hase的形成［13］。⑥羊膜用于热烧伤、化学烧伤引起的眼表疾病，尤其是双眼结膜大片瘢痕、睑球粘连以及穹窿部缩窄分离松解后等创面的修复术，羊膜能提供一个含基底膜和基质成分的胶原支架，以使受体及结膜或角膜表型的上皮细胞扩展移行于其上达到真正的结膜及角膜眼表的重建。
    
　　另外，羊膜尚可用于构建人工角膜［14］、药物缓释系统［15］、泪囊鼻腔造口术［16］。

　　6  手术方法及术后处理
    
　　羊膜的术前选择：新鲜羊膜及保存羊膜结构的完整性对羊膜移植的疗效均有显著影响。术前的羊膜常规病理检查能为术者选择优质羊膜提供客观依据，从而提高羊膜移植的疗效［17］。羊膜移植重建眼表的显微手术要点：①彻底清除病变组织：急性炎症期的眼表面坏死组织应该清除干净;瘢痕期的病例，术中应充分分离睑球粘连，切除增殖的瘢痕组织，恢复眼球的运动功能。否则会影响术后羊膜植片的存活甚至发生溶解;②创面的烧灼止血：急性期眼表清创或瘢痕期眼表彻底松解后创面的活动性出血点必须充分止血，否则可引起羊膜植片下积血，导致移植片延迟愈合甚至溶解、坏死;③羊膜植片的缝合固定：羊膜与周边结膜及移植床组织裸露创面的仔细、充分地缝合固定至关重要，它不仅有利于羊膜植片的贴附和生长，还有利于受体正常表型的眼表上皮细胞增殖、移行于羊膜植片之上。此外术中应确保穹窿部形成良好，必要时可考虑作2对穹窿部的临时提吊缝线，于眉毛下缘的皮肤穿出并用小硅胶片在皮肤面结扎，2周后拆除［8］。
    
　　术后常规绷带加压包扎，尽早敞开滴眼，对泪液功能分泌缺乏者，可频繁滴用人工泪液，联合角膜缘移植或板层角膜移植术者加用糖皮质激素眼液和1%的环孢素Ａ油剂滴眼。

　　7  预后
    
　　钟一声等［11］报道对12只新西兰兔行小梁切除，术中1眼于巩膜瓣间放置6mm×4mm的羊膜植片，另一眼作为对照。结果实验组术后1、2、3周滤过泡轻微隆起弥散，有较好的滤过功能，对照组术后2，3周滤过泡区瘢痕形成，滤过功能差。组织学检查显示，实验组滤过泡未形成瘢痕，成纤维细胞少，对照组滤泡区被增生的纤维组织所代替，成纤维细胞丰富。在难治性青光眼研究方面，刘永民等［12］对青光眼兔模型随机分为对照组、单纯引流管植入组、引流管植入加羊膜移植组和引流管加羊膜支架植入联合羊膜移植组。结果表明3个月后单纯引流管植入组较对照组眼压无显著降低(P=0.274);引流管加羊膜移植组与对照组比有显著降低眼压作用(P=0.02)；与单独引流管植入组差异无显著性(P=0.113);引流管加羊膜支架加羊膜移植组与对照组和单纯引流管组相比，均有显著降低眼压作用(P=0.001，P=0.036)。管周组织通透性研究表明联合羊膜移植的两组引流管和管周组织均有较好的通透性，病检查显示虽然管周组织有明显的纤维组织增生，但与单纯引流管相比，管周无明显的致密层，说明羊膜有抗瘢痕作用。同期另一临床研究显示，角膜移植术后难治性青光眼行引流管植入联合羊膜移植与单纯行单盘Molteno植入物植入对比，术后1年控制眼压成功率分别为65.3%和52.5%，两组间差异和并发症发生率对比差异无显著性。说明引流管植入联合羊膜移植能够促进房水的排出，是治疗难治性青光眼的有效方法之一。罗舒娅等［18］羊膜移植在新生血管性青光眼手术中应用的临床观察3例3眼术后随访4～6个月，平均5.3个月，眼压控制在1.33～2.26kPa未发现排斥反应。汤爱菊等［19］用新鲜羊膜联合小梁切除术治疗原发性青光眼27例27眼，平均随访观察5.8个月。1眼眼压在4.66kPa，26例26眼眼压控制在1.06～2.66kPa。眼压控制成功率为96.2%，眼压曲线平稳，滤过泡呈弥散、扁平、无充血，术后所有病例视力均有不同程度的提高。
    
　　柯建林［20］等用同种异体羊膜移植治疗翼状胬肉16例16眼，复发性翼状胬肉15例15眼，睑球粘连8例8眼，经过6～18个月的临床观察无一例复发，睑球粘连解除，无排斥反应发生，角膜上皮稳定，手术区结膜上皮生长正常。李淑珍［21］行翼状胬肉逆行切除+羊膜移植治疗31例32眼翼状胬肉患者，随访观察6～8个月，仅有1眼复发性翼状胬肉术后睑球粘连。
    
　　陈家棋［8］等利用新鲜羊膜移植治疗严重的急性炎症期及瘢痕期眼表疾病55例63眼术后临床上均未见新鲜羊膜植片急性排斥反应。严重急性眼烧伤的6眼中，术后5眼无角结膜进行性溶解和穿孔，无新生血管和假性胬肉侵人角膜表面，虹膜亦未见萎缩，视力有不同程度提高。复发性蚕蚀性角膜溃疡8眼术后未见复发。严重睑球粘连49眼中，46眼恢复了眼球的运动功能，3眼术后3个月再次发生睑球粘连。泪液分泌功能基本正常者羊膜上皮细胞移植后可存活约3个月。

    
　　周世有［22］等对全角膜Ⅳ度以上烧伤且全周角膜缘坏死的临床连续病例分别采用羊膜移植(19例20眼)或全板层角膜移植手术(22例24眼)。19例羊膜移植患者中8例8眼接受新鲜羊膜移植，11例12只眼接受保存羊膜移植。患者术后随访12～26个月，平均15±2个月。结果：羊膜移植后眼表迅速稳定。新鲜羊膜移植者眼表面迅即并维持上皮化。保存羊膜移植者第2或3周才完成上皮化，且12眼中有3眼不能完全上皮化，最后由于持续性上皮缺损而发生羊膜溶解，其后接受了板层角膜移植。眼表上皮化的术眼随着时间的延长新生血管开始沿着羊膜从角膜周边长入，羊膜被逐渐吸收。新生血管多为表浅性。新鲜羊膜多数(7/8)在术后2～8(4.3±0.8)个月、保存羊膜多数(10/12)在术后1～3(2.0±0.3)个月基本被吸收或溶解(t=4.22，P<0.01)。羊膜移植重建的结膜眼表均获成功，仅1例发生影响眼球运动的中度睑球粘连。板层角膜移植组22例(24眼)均保全眼球，但在术后大多发生角膜植片上皮反复脱落，最终植片新生血管化，其中4眼由于角膜植片溶解而接受植片更换，7眼因植片上皮持续性缺损而行睑缘缝合术，5眼发生轻中度睑球粘连。在无合并青光眼和白内障的患者中，羊膜移植术后的视力基本保留了眼前手动，而板层角膜移植者则多见眼前指数。
    
　　全雄［23］等对热烧伤性角膜溃疡2眼，化学性烧伤角膜溃疡1眼，外伤性感染性角膜溃疡4眼，蚕蚀性角膜溃疡5眼，均行新鲜羊膜移植术。结果随访6～12个月，蚕蚀性角膜溃疡无复发，视力有不同程度提高，热烧伤2眼术前视力由0.1以下提高到0.3，外伤性感染性角膜溃疡2眼视力达0.1，2眼白斑愈合，保存眼球。其中化学性烧伤1眼失败。膜在创面上要展平，不要有皱褶，将羊膜植片全周边缘与结膜创缘缝合固定，缝线须经过表浅巩膜，再在3、6、9、12点将羊膜植片固定于浅层巩膜，多余羊膜剪除。缝线用10-0尼龙线。术后结膜下注射庆大霉素2万u，加压包扎。结果12例患者中，11例羊膜移植片未见溃烂、溶解、吸收，无新生血管长入，周边对合良好。术后3～5天羊膜轻度水肿，随后渐透明，厚度正常。术后1～2周角膜溃疡愈合。

　　8  结语
    
　　综上所述，羊膜因含有独特的结构：无血管基质及厚的基底膜。无血管基质可以防止纤维瘢痕组织的形成、控制排斥反应的发生。厚的基底膜有利于上皮细胞的移行，增加基底上皮细胞的粘附，促进上皮化，防止上皮细胞凋亡。正是因为羊膜的这些特点，所以才会对严重眼表疾患发挥治疗作用或作为联合角膜缘移植重建健康眼表的第一步。因此应用并巧用羊膜于眼科临床中，必然成为眼中密切关注领域，并具进一步深入研究的价值及更广泛的开发前景。在今后的研究中，应着重研究羊膜移植术后眼表上皮的功能，羊膜基质与成纤维细胞的相互作用等，以便进一步阐明羊膜移植重建健康眼表的机制，有助于理解伤口的愈合过程，揭示羊膜移植的其他潜在性用途。

 

【】
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