高脂血症对孕期大鼠急性胰腺炎的影响

【摘要】  目的：探讨高脂血症对孕期大鼠急性胰腺炎(AP)的影响。方法：妊娠大鼠随机分为实验组(高脂饲料)和对照组(均衡饲料)，分别喂养16d后，用L-精氨酸盐酸盐(L-Arg)溶液(250mg/100g)进行腹腔注射，1h后再次腹腔内注射(200mg/100g)。48h内大鼠死亡率，分别于末次注射后0、12、24和48h检测血清甘油三酯(TG)、淀粉酶(AMS)和脂肪酶(LPS)；计算胰腺湿/干重比值；观察胰腺组织的病理变化并评分，免疫组化SP法检测胰腺组织Bax表达。结果：实验组死亡率8.3%，对照组0.0%。实验组TG较对照组明显升高(P<0.05)；实验组AMS、LPS峰值分别在24、12h出现，对照组都在24h出现且明显较实验组低(P<0.05)。在L-Arg末次注射后12、24h，实验组胰腺湿/干重比值较对照组升高(P<0.05)，胰腺水肿出血、炎症浸润也较对照组更重，病理评分更高(P<0.05)。Bax表达的峰值提早出现，且比对照组高(P<0.05)。结论：高脂血症能使L-Arg诱导的孕期AP提前出现，在此过程中凋亡基因Bax可能参与诱导胰腺腺泡的凋亡，从而减轻胰腺炎的严重程度。

【关键词】  孕期；高脂血症；急性胰腺炎；精氨酸

　　［Abstract］Objective: To study the influence of hyperlipemia on acute pancreatits(AP)of rats during pregnancy. Methods: SD rats in pregnancy were randomly divided into the test group and the control group，fed for 16 days separately. Rats in pregnancy were given intraperitoneal injection with L-arginine for 2 times(the first time 250 mg/100 g,the second time 200 mg/100 g)at an interval of one hour. After the last injection, the mortality of rats in pregnancy within 48 hours calculated. The serum triglyceride(TG)、serum amylase(AMS)、lypase(LPS)from blood samples and wet/dry ratio of pancreas were tested at the point of 0、12、24 and 48 hours. The pancreatic histopathological score based on microscopic changes was evaluated. The expression of Bax protein was determined by SP immunohistohemical technique. Results: After the last injection, the mortality of the test group  was 8.3%, but 0.0% of the control group. The level of TG in the test group was higher than that of the control group. AMS、LPS in the test group peaked at 24- and 12-hour individually while AMS、LPS in the control group both peaked at 24-hour and lower than that of the test group obviously(P<0.05). Compared with the control group, the wet/dry ratio of pancreas of test group increased at 12- and 24-hour(P<0.05). The pathological changes of pancreas of test group were more serious and the pancreatic histopathological score was also higher, with the expression of the Bax protein serious, too. Conclusion: L-Arg-induced-AP during pregnancy would appear ahead of schedule becasuse of hyperlipemia. Bax gene may contribute to acinar cell apoptosis and reduce the severity of AP.

　　［Key Words］pregnancy;hyperlipemia；acute pancreatitis；L-arginine

    急性胰腺炎(AP)的发病率呈逐年上升趋势［1］，妊娠合并AP不多见，但其具有发病急、死亡率高的特点，对母婴有极大的危害。妊娠合并AP的病因目前尚不清楚,有研究显示,妊娠合并AP者，血清胆固醇、游离脂肪酸(FFA)、甘油三酯(TG)、脂蛋白均明显增高，临床发现，12％～38％的AP患者伴血脂异常升高［2，3］，在某些家族性高脂血症患者和妊娠高脂血症患者中常反复发生AP。一般认为，当Ⅰ,Ⅳ,或Ⅴ型(Fredrickson?s分类)高脂血症患者在血清TG达到(11～22)mmol/L或以上可直接诱发AP［4］。那么通常的高脂饮食所致的高脂血症(TG较正常高3倍左右)是否会诱发妊娠期AP？还是其发生的一个危险因素？本实验将对此进行探讨。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物

    健康性成熟SD大鼠雌性48只(体质量180～220g)，雄性24只(体质量220～250g)，均由汕头大学医学院实验动物中心提供。

　　1.2  试剂与仪器

    L-精氨酸盐酸盐(L-Arg)，分析纯级(BBI公司，加拿大)。使用时用体积分数0.9%的NS配成质量分数20%的L-Arg溶液(pH＝7.0)。Bax抗体免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，)，盒中抗体为兔抗Bax(Santa-Cruz公司，美国)。CX9全自动生化分析仪、电热恒温干燥箱、低温高速离心机(贝克曼公司，美国)，1604型精密天平(上海实验仪器厂，中国)，SPOT及IPP图像采集分析系统(Media Cybernetics公司，美国)。

　　1.3  方法

　　1.3.1  动物分组及模型制备 

　　大鼠按雌雄比(2∶1)合笼进行交配，饲养于标准动物房(22℃)，给予光照(12h∶12h)，自由饮食。发现有阴道栓后记为妊娠第1d，并随机分为实验组［高脂饲料(83％的均衡饲料，15％的猪油，2％的胆固醇)］和对照组(均衡饲料)，每组24只。所有大鼠在实验前禁食12h，自由饮水。两组分别喂养16d后，用L-Arg溶液先于腹腔内注射(250mg/100g)，1h后，再次腹腔注射(200mg/100g)。

　　1.3.2  标本制备 

　　两组分别于末次注射L-Arg溶液后0、12、24和48h各取6只处死(如处死时未发现大鼠怀孕，不纳入实验)，取门静脉血，分离血清，-70℃冰箱保存。同时切取大鼠胰腺组织，一分为二，一部分备于胰腺湿/干比率测定，另一部分用多聚甲醛固定，石蜡包埋，备用于组织病检查及免疫组化检测。

　　1.4  观察指标

　　1.4.1  两组死亡率 

　　观察两组在注射后各时间点的死亡情况并计算其死亡率。

　　1.4.2  血清TG和淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS) 

　　用CX9全自动生化分析仪检测。

　　1.4.3  胰腺湿/干重比值

　　两组大鼠于各时间点处死后，切取的胰腺组织于电子天平上称重(湿质量)；再将切取的胰腺组织于60℃烘干24h，至质量不变为止(干质量)，计算湿/干重比值。

　　1.4.4  胰腺组织Bax表达 

　　采用免疫组化SP法，其操作步骤严格按SP免疫组化染色试剂盒说明进行，结果判断：胰腺细胞胞浆染色呈棕褐色或棕黄色为阳性细胞。免疫组化结果用SPOT及IPP图像采集分析系统处理，40×10视野下观察采集图像，Imageproplus4.1版专业图像分析软件处理结果，以平均光密度值表示Bax表达的相对强度，由病理科医生进行双盲检验。

　　1.4.5  胰腺组织病理学改变及病理评分(表1)

　　石蜡切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察其病理改变，并按照Schmidt镜下病理评分标准［5］由病理科医生进行双盲评分。表1  胰腺组织病理评分标准（略）

　　1.5  统计学处理

    全部数据以x±s表示，计量资料结果采用SPSS11.0软件进行方差分析；组织病理学评级比较采用秩和检验，检验水准为α=0.05。

　　2  结果

　　2.1  两组死亡情况

    实验组12、24h死1只，24、48h死2只，总死亡率8.3%。对照组48h内无死亡。

　　2.2  血清TG和AMS、LPS的测定结果

    在相同时间点，实验组比对照组TG明显升高(P<0.05)；实验组的AMS、LPS值分别在24、12h出现，而对照组都在24h出现且明显比实验组降低(P<0.05，表2)。表2  两组不同时间点TG、AMS和LPS的测定结果（略）

　　2.3  胰腺湿/干重比值结果

    在12、24h，实验组比对照组胰腺湿/干重比值明显升高(P<0.05)，在0、48h略有升高(P>0.05，表3)。表3  两组不同时间点胰腺组织湿/干重比值结果（略）

　　2.4  胰腺组织Bax的检验结果

    胰腺组织中Bax表达于细胞胞浆，实验组在12h的平均光密度值最高且比对照组表达明显升高(P与对照组比  1)P<0.05  2)P>0.05<0.05)，而对照组在24h最高，两组都随着时间点的推移呈下降趋势(P>0.05，表4)。表4  两组不同时间点胰腺组织Bax的表达结果（略）

　　2.5  胰腺组织病理评分

    实验组0h镜下见局限胰腺小叶间充血，伴有个别炎症细胞浸润，但小叶结构完整，无水肿、出血。12h见小叶间明显充血，局限水肿，炎症细胞浸润增多。24h见腺泡张力加大，腺泡细胞内大量空泡形成，分隔小叶，伴有点状坏死和出血，大量炎症细胞浸润。48h小叶间及小叶内广泛重度水肿，小叶结构弥漫性破坏、丧失，出血严重，炎症细胞弥漫性浸润。对照组0、12和24h与实验组比胰腺病理损伤明显减轻(P<0.05),48h有所减轻，但无统计学意义(表5)。光镜下，两组胰腺病理示典型的AP(图1、2,封2)。表5  两组不同时间点胰腺组织病评分结果（略）

　　3  讨论
  
　　妊娠合并AP的发病率为1/1000～1/5000［6］，发病时与同龄女性非妊娠AP相比，其临床表现和生化指标(AMS、LPS等)变化明显。但妊娠期高脂血症是引起AP的原因或是结果目前尚不明确。单纯妊娠期高脂血症尚不足以直接导致AP，但在某些状况(孕妇年龄较大，初次妊娠，糖尿病，先兆子痫以及TG代谢紊乱)下，这种妊娠期血脂生理性升高可能成为导致AP的病理性因素［7］。本实验中，实验组血清TG明显升高至正常的3倍左右，说明高脂饲料喂养能够在短时间内引起妊娠大鼠TG升高，且较静脉给药更符合生理特点。在L-Arg溶液末次注射后0h时，发现胰腺病理变化只有血管内充血、中性粒细胞浸润，没有出现细胞水肿等情况，说明单纯高脂饮食导致的高脂血症只能引起胰腺病理的轻微改变，尚不足引起AP。
   
　　通常胰腺腺泡细胞的受损是AP的初始病理变化，一定剂量的L-Arg能减少、抑制核酸及蛋白质合成，而胰腺腺泡细胞的蛋白质合成最为活跃，因此极易受损。本实验中，对两组末次注射L-Arg后都发现胰腺有明显的炎症性病理损害，说明L-Arg能成功诱导出大鼠AP。研究发现，胰腺腺泡细胞的凋亡程度与AP的轻重程度成负相关。诱导凋亡可明显减轻胰腺炎的病情［8］，其机制可能是胰腺炎发生后出现的炎症细胞聚集和炎症细胞产生导致的瀑布样效应是影响胰腺病情的主要因素，而腺泡细胞的死亡方式决定了瀑布样反应的程度，进而影响AP的病情轻重。Bax基因是凋亡调控基因Bcl-2家族成员，当Bax过表达时可促进细胞凋亡。本研究结果显示，实验组在12h的平均光密度值最高，而对照组是在24h最高，说明实验组的急性炎症比对照组提前出现，而随着时间点的推移呈下降趋势，说明胰腺炎越来越严重，这可能与高脂血症的影响有关。

    妊娠晚期，合体滋养细胞分泌的胎盘生乳素有显著的脂肪分解作用，TG将释放出大量FFA，而FFA可能通过以下3种机制损害腺泡细胞①TG在胰腺中被胎盘解毒分解，产生过量的FFA对腺泡细胞的直接损伤；②FFA诱发酸中毒，胰蛋白酶原激活加速；③胰腺微循环障碍，而妊娠时各种内分泌激素的分泌、各种细胞因子、炎症介质的释放更加重了FFA对胰腺毛细血管的损害。本实验可看出在相同时间点上实验组TG值远比对照组高，且实验组在0～24h间随着时间点的推移，TG逐渐下降，说明TG可能在此过程中由于脂肪分解作用大量释放出FFA,导致腺泡细胞损害加重。而胰腺腺泡细胞的损害，加重了AMS、LPS的释放，从实验结果可见实验组的AMS、LPS峰值都比对照组的提前出现，说明高脂血症能加速AP的诱发，且病情更重。

    本研究中，实验组相对于对照组的胰腺湿/干重比值在12、24h明显升高(P<0.05)，说明在12～24h这个时间段内，实验组胰腺水肿较对照组重，随着胰腺组织从水肿向坏死，在48h时间点两组的差别并不大。而胰腺病理在0时间点实验组有血管内充血、中性粒细胞浸润，但没有出现细胞水肿等情况，而对照组在这时间点基本上无变化；随着时间点的延续，胰腺损害程度加剧，在12和24h两组比较胰腺病理损伤明显加重(P<0.05), 48h有所加重，但无统计学意义。以上结果说明在相同情况下实验组在末次注射L-Arg后0h时AMS、LPS都比对照组的高，胰腺病理也有轻微损害；通过0、12、24和48h的各项指标的观察比较(表2～5)可见在L-Arg的诱导下实验组较对照组的AP提早出现且更重，从而提示高脂血症对孕期AP来说是一个危险因素。

    总之，高脂血症时FFA的升高等因素和妊娠期特有的激素水平变化等因素的叠加使妊娠时发生的AP更加凶猛，后果更加严重，而在此过程中，可能通过上调Bax诱导胰腺腺泡的凋亡，从而减轻胰腺炎的严重程度。

【】
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