抗精液抗体对精子线粒体功能的影响

                 作者：陈德宇，刘丽敏，谢庆东，黄天华

【摘要】  目的：探讨抗精液抗体与线粒体功能之间的关系。方法：制备抗精液抗血清，用其处理精子后，做精子活力分析、精子凝集实验、精子线粒体功能分析、体外受精及精卵融合实验，分别探讨抗精液抗体在体外制动精子的机制以及抗精液抗体与线粒体功能之间的关系。结果：抗精液抗体能够完全凝集和制动精子；流式细胞仪检测结果表明实验组精子线粒体平均荧光强度为91.45±21.02，对照组358.7±137.81(P<0.01)；体外受精实验中实验组未见受精卵，对照组有卵子受精。结论：抗精液抗体在体外能够完全凝集和制动精子，可以阻止精卵融合。抗精液抗体可以介导精子的凋亡。

【关键词】  抗精液抗体；体外杀精剂；精子凝集；体外受精；线粒体；凋亡

　　［Abstract］Objective: To study the relation of anti-semen antibody and the function of mitochondrion. Methods: The anti-semen antibody was prepared and the sperm motility rate, spermagglutination, sperm mitochondrial function analysis and in vitro fertilization were analyzed. Results: Anti-semen antibody could agglutinate and immobile sperm completely. The average sperm mitochondrion fluorescence intensity was 91.45±21.02 in the experiment group and 358.79±137.81 in the control group, the rate of fertilization in vitro fertilization was different between two groups. Conclusion: Anti-semen antibody can agglutinate and immobile sperm in vitro, and it can affect the function of mitochondrion.

　　［Key Words］anti-sperm antibody； spermicide； spermagglutination; in vitro fertilization; mitochondrion；apoptosis

    细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自行结束生命的过程［1］。细胞最后裂解成若干凋亡小体，被其他细胞吞噬［2］。线粒体是细胞内产生能量的重要细胞器，死亡受体介导的信号、生长因子抑制剂、抗癌药物等可使线粒体的功能损伤，诱导细胞凋亡［3～5］。有报道抗精子抗体与不孕不育之间的关系［6～8］，但抗精子抗体与线粒体功能之间的相关性未见有关报道。本研究制备抗精液抗体，旨在探讨抗精液抗体在体外的抑精机制，分析抗精液抗体与线粒体功能之间的关系。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

    新西兰大白兔(上海实验动物有限公司，)8只，体质量2～3kg。完全福氏佐剂和不完全福氏佐剂(上海生物工程有限公司，中国)，Bradford试剂盒、羊抗兔IgG-HRP(博士德生物有限公司，中国)，ProteoExtract天然膜蛋白提取试剂(Merck公司，德国)，DePsipherTM试剂盒(America公司，美国)，其它生物化学试剂为本室储备品。

　　1.2  方法

　　1.2.1  精液获取 

　　10份正常精液来自汕头大学医学院生殖医学研究中心，志愿者年龄23～30岁，平均26.4岁。手淫法收集精液标本，37℃液化2h，上游法获取活力高的精子，用WLJY-9000伟力彩色精子质量分析系统(北京伟力新世纪科技有限公司，中国)测定精子活力及精子密度。

　　1.2.2  免疫 

　　将1mL上述精液与1mL完全福氏佐剂充分混匀，于新西兰兔皮下注射，每点注射100μL，免疫1周后，皮下注射精液与不完全完全福氏佐剂的混合液，免疫1次/周，免疫4周，心脏采血，常规法分离血清。Bradford法测定血清浓度。

　　1.2.3  效价测定
 
　　ELISA法测定效价。采用ProteoExtract天然膜蛋白提取试剂盒，根据其操作说明书提取精子膜蛋白。将精子抗原按1∶800稀释包被酶标反应板，4℃过夜；弃上清，PBST(含体积分数0.1%的Tween的0.01mol/L磷酸盐缓冲液)洗板4次，每次3min；用质量分数5%的脱脂奶粉封闭微孔板，每孔200μL，37℃ 2h；PBST洗板4次，每次3min；取2倍比例稀释的血清每孔100μL，37℃ 60min，用正常兔血清做阴性对照；PBST洗板4次，每次3min；加1∶2000稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG 100μL，37℃ 60min；PBST洗板4次，每次3min；每孔加显色液50μL，37℃ 10min；每孔加2滴H2SO4(1mol/L)终止反应，450nm比色记录结果。

　　1.2.4  精子活力分析
 
　　取5份正常精液，液化后于37℃采用上游法获取高活力精子，用BWW(NaCl　0.554g/L、KCl 0.0356g/L、CaCl2 0.025g/L、KH2 PO4 0.0162g/L、MgSO4·7H2O 0.0294g/L、NaHCO3　0.210g/L、NaPyr 0.003g/L、Nalac O.370g/L、Glucose 0.100g/L、质量分数0.5％的酚红1.0mL、青霉素10000u、质量分数0.3%的BSA)1000g×5min清洗2次，再用BWW悬浮精子，并调整精子密度为107个/mL。取7个小离心管，每管加入100μL精子后，分别加入100、50、25、12.5、6.25、3.1μL、0抗血清，37℃孵育120min后，用机辅助分析系统分析精子活力。

　　1.2.5  精子凝集 

　　取100μL液化的正常精液溶解于300μL PBS溶液中，加入50μL抗血清，37℃孵育30min，取10μL混合液于光学显微镜下检查精子凝集情况。用未加抗血清的精液作对照。

　　1.2.6  体外受精及精卵融合实验 

　　取性成熟雌性金黄地鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)5～10U/只，48h后，腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)10U/只，18h后，颈椎脱臼法处死雌鼠，剖开腹腔，取出双侧输卵管，将其置于盛有BWW(BSA)培养基的培养皿中。在解剖显微镜下，刺破输卵管膨大部分，挤压输卵管，使卵丘细胞进入培养基中；在另一培养皿中加入含有质量分数0.1%的透明质酸酶的BWW，转移卵丘于培养皿中，轻轻吹打，使包裹于卵母细胞外的卵丘细胞在透明质酸酶的作用下溶解，用BWW充分洗涤去透明带卵母细胞3次；将卵母细胞置于盛有BWW的培养皿中，置入37℃、体积分数5%的CO2培养箱中备用。精子常规方法获能后，制备成受精液滴，在受精液滴中加入50μL浓度为1000μg/μL的抗精液血清，对照组加入正常兔血清。将卵母细胞加入制备好的实验组和对照组受精液滴中，5% CO2，37℃受精1h；吸出受精后的卵母细胞，用体积分数2.5%的戊二醛室温固定30min后压片。倒置显微镜下观察。

　　1.2.7  流式细胞分析

　　用DePsipherTM试剂盒按其操作步骤在流式细胞仪中测定精子线粒体功能。取1mL液化的正常精液溶解于10mL PBS溶液中，500×g离心5min，PBS调整精子密度为106个/mL，于1mL精子悬液中加入1mL DePsipher(终浓度5μg/mL)，37℃ 5% CO2孵育30min后，用PBS 500×g离心5min清洗2次。在流式细胞仪中于488nm测定精子线粒体平均荧光强度。每份标本检测10000个精子。

　　1.3  统计学处理

    采用SPSS 13.0统计软件分析。所有数据以x±s表示，t检验。

　　2  结果

　　2.1  抗体制备

    将精液免疫新西兰兔5周后，心脏采血，常规法分离血清。Bradford法测定血清蛋白质浓度，所得抗精液抗血清蛋白质浓度为1400μg/μL。ELISA法测定抗血清效价为1∶512。

　　2.2  精子凝集实验

    在阴道内直接用抗精液血清凝集精液蛋白及制动精子，使其丧失受精能力，因此我们直接用精液免疫家兔。精子凝集实验中，几乎所有的精子都被凝集，未见散个精子存在(图1，封2)，结果表明抗精液抗体在体外完全能够凝集精子。

　　2.3  精子活力分析

    取5份人精液，用上游法获取高活力精子，药物动力学实验结果:精子被抗体作用2h后，随着抗体浓度的增加，精子活力依次降低。不稀释的抗体，可以在30s内杀死所有精子，1∶2稀释的抗体，可以在1min内制动所有精子(图2)。

　　2.4  体外受精及精卵融合实验

    常规法取出雌鼠成熟卵细胞，将精子用抗体处理后，做体外受精。实验组中抗精液抗体能够完全抑制精卵受精(图3A，封2)，对照组中卵子形成了雌雄原核，已经受精(图3B，封2)。

　　2.5  线粒体功能分析

    精子用抗体处理后，Rh123染色，用流式细胞仪检测精子线粒体的膜电位(表1)。实验组精子平均荧光强度与对照组间有统计学意义(P<0.01)。表1  精子线粒体平均荧光强度比较（略）

　　3  讨论
   
　　本研究中，我们制备了抗人精液抗体，研究了该抗体对精子的药物动力学、精子凝集、精子穿卵等实验的影响。药物动力学实验结果表明，随着抗体浓度的增加，精子活力依次降低，不稀释的抗体可以在30s内制动所有精子。药物动力学实验结果表明，抗精液抗体制动精子功能显著。精子凝集实验中，所有精子都被凝集，未见散个精子存在，凝集实验表明，抗精液抗体能够凝集精子，对照组中，所有精子散个存在，未见凝集,此实验结果显示，抗精液抗体能够完全抑制精卵融合。上述实验结果都表明，抗精液抗体在体外完全能够制动精子。在线粒体功能分析实验中，实验组精子线粒体平均荧光强度显著低于对照组，表明抗精液抗体能够影响线粒体膜电位差。精子尾部的线粒体是精子运动的能量加工厂，线粒体功能被抗精液抗体抑制后，精子的活率会降低，这可能是抗精液抗体制动精子的主要原因之一。这个结果也提示抗精液抗体可以介导精子的凋亡。

    精子活力是衡量精液质量和男性生育能力的一个重要指标。线粒体功能障碍影响到细胞的有氧代谢，线粒体的ATP合成酶对于精子活力是必须的［9］。Rhl23是一种亲脂性阳离子荧光染料，其荧光信号上要集中于线粒体，荧光强度的变化反映了线粒体膜电荷的变化。本实验发现被抗精子抗体作用后线粒体功能良好的精子数目明显减少，表明精子线粒体的跨膜电位受到影响。线粒体跨膜电位的变化主要是由于线粒体内膜的通透性转变，这是由于生成了动态的多个蛋白质组成的可于线粒体内、外膜接触位点的通透性转变孔道(PT孔道)。线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷脂酰丝氨酸暴露于细胞表面［10,11］。多数情况下，线粒体膜电位的降低，表明线粒体膜通透性转运孔(MPT)的开放导致线粒体释放caspase活化物，活化caspase，引起细胞凋亡。因此，我们推测抗精子抗体可能诱导精子凋亡［12,13］。

    关于抗精液抗体如何调节线粒体功能以及线粒体释放凋亡蛋白的生化机制等问题有待进一步阐明，以便更好地了解线粒体诱导凋亡的生化途径及相关调节机制，从而为阐明抗精液抗体介导的男性不育的发病机制并发现新的药物提供新的途径。

【】
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