能量限制诱导的Sirt1高表达对胰岛β细胞的寿命及胰岛素分泌功能的影响

                作者：朱志宏，陈慎仁，傅玉才，魏炽炬，林超，杨杰华

【摘要】  目的：研究能量限制(CR)对大鼠胰岛及胰岛β瘤细胞(NIT-1细胞)寿命和胰岛素分泌功能的影响，为2型糖尿病(T2DM)的发病机制及防治提供实验依据和理论基础。方法：①18月龄健康雄性SD大鼠12只随机分为CR组和对照组，饲养6个月后取胰尾组织进行实验，用免疫组化染色检测胰岛中Sirt1和insulin表达水平，β-半乳糖苷酶(β-Gal)染色反映胰岛细胞衰老情况；②NIT-1细胞亦分为对照组和CR组；用RT-PCR、免疫细胞化学染色检测Sirt1的表达变化，用放射免疫及免疫细胞化学检测胰岛素的分泌及表达量的变化，用细胞计数法检测细胞倍增周期的变化。结果：①Sirt1在SD大鼠胰岛及NIT-1细胞的胞浆胞核中均有表达，CR组Sirt1表达量均增加；②CR可使大鼠胰岛β-Gal染色阳性率下降、NIT-1细胞倍增周期延长；③CR可使大鼠胰岛及NIT-1细胞胰岛素表达量明显减少，NIT-1细胞胰岛素分泌量亦明显减少。结论：CR通过上调Sirt1基因的表达而延缓β细胞的衰老，CR还通过减少胰岛素的表达及分泌从而减少胰岛素信号的刺激，减轻β细胞的负荷并改善胰岛素的分泌功能，因此CR有利于防止T2DM的发生。

【关键词】  能量限制；Sirt1；胰岛素；2型糖尿病

　　［Abstract］Objective: To investigate the effects of calorie restriction(CR)on life span and insulin secretion in the pancreatic islet of SD rat and β neoplastic cell(NIT-1 cell), and to provide some evidences for pathogenesis and prevention of type 2 Diabetes Mellitus(T2DM). Methods: ①Twelve male SD rats of 18 months old were randomized into CR and control groups. The caudal end of islet was collected after 6 months of breeding. The expressions of Sirt1 and insulin were detected by immunohistochemistry, β-galactosidase(β-Gal)was utilized to identify the senescent in pancreatic islets. ②NIT-1 cell was also divided into CR and control groups. The expression of Sirt1 was detected by RT-PCR and Immunocytochemistry, the secretion and expression of insulin were detected by radioimmunity and immunocytochemistry, the cell multiplication cycle was calculated by cytometry. Results: ①Sirt1 hyper-expression was discovered in the CR group, Sirt1 expressed both in plasma and nucleus. ②The positive ratio of β-Gal was diminised in the islet and the cell multiplication cycle was extended in NIT-1 cell by CR. ③Insulin expression was obviously decreased both in the islet and NIT-1 cells treated with CR, besides, the secretion of insulin was also decreased in NIT-1 cell. Conclusion: CR delays the aged proceeding of β cell by enhancing the expression of Sirt1. CR weakens the insulin signal by decreasing the expression and secretion of insulin, and finally softens the burden of the β cell, improves the function of insulin secretion. CR may participate in the generation and development of T2DM.

　　［Key Words］calorie restriction；Sirt1；insulin ；type 2 diabetes mellitus

    有学者在细胞培养中发现，把培养基中的葡萄糖由2%减少到0.5%或更少，达成对酵母细胞的能量限制(Calorie　restriction，CR)，其寿命延长了30%～40%［1］。对人类，CR最重要的影响是它能延缓衰老从而减少很多疾病［包括2型糖尿病(T2DM)、肿瘤和心血管疾病］的发生，其中受益最明显的是T2DM，与之直接相关的是胰岛β细胞的功能。临床和流行病学调查表明，随着人类年龄的增长，β细胞分泌胰岛素功能逐渐减退，T2DM及糖耐量受损患病率逐渐增高［2］，T2DM病人胰岛素抵抗及胰岛β细胞逐渐衰老衰竭伴随整个病程。那么CR是怎样使T2MD病人受益的呢？研究发现，CR可能是通过激活Sir2而起作用的［1］。Sir2是在酵母细胞中被发现的与酵母配位型基因沉默、端粒区基因沉默及rDNA重组维持基因稳定性有关的重要基因［3］，具有组蛋白去乙酰化酶活性［4］，与多种细胞的衰老密切相关［5］。我们的研究旨在通过用体内外实验，探讨CR对Sirt1(Sir2在哺乳动物的同源基因)的调节作用及其产生的作用，论证CR在体内、外均可使胰岛β细胞寿命延长，胰岛素分泌功能改善，为进一步阐明T2DM发生发展机制提供实验依据，并有利于其防治。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验材料

　　1.1.1  实验动物 

　　18个月龄健康雄性SD大鼠(汕头大学医学院实验动物中心提供)12只。

　　1.1.2  实验细胞
 
　　NIT-1细胞由美国标准菌库(ATCC)保存，ATCC?号：CRL-2055ＴＭ。NIT-1细胞系来自NOD/Lt小鼠胰腺胰岛β细胞，是转染了肉瘤病毒40后自发的胰岛素瘤细胞，培养基中的葡萄糖可刺激它分泌胰岛素，与胰岛β细胞有非常相似的生理功能。

　　1.1.3  主要试剂 

　　胎牛血清FBS(KPL公司，美国)、高糖(质量分数0.45%的葡萄糖)及无糖DMEM(GIBICO公司，美国)、胰酶+EDTA(GIBICO公司，美国)、兔抗鼠Sirt1多克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)、鸡抗鼠Insulin抗体(Abcam公司，英国)、辣根过氧化物酶标记(HRP)的山羊抗鸡2抗(KPL公司，美国)、生物素标记的山羊抗兔IgG抗体(KPL公司，美国)、ABC(avidin-biotin complex)试剂盒(Vector Laboratories公司，美国)、胰岛素放射免疫分析药盒(北京北方生物技术研究所，)、总RNA提取试剂盒及cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN公司，中国)、PCR试剂盒(TIANGEN公司，中国)、6×DNAloading buffer(TIANGEN公司，中国)、DNA Marker(Santa Cruz公司，美国)、PCR引物(上海基康公司，中国)(18S上游5′-ATTCCGATAACGAACGAGAC-3′，下游5′-GGCATCACAGACCTGTTATTG-3′；Sirt1上游5′-AACCTCCTGTTGACC-GATG-3′，下游5′-CCGTCTCTTGATCTGAAGTCA-3′)。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  实验动物分组与取材 

　　大鼠随机分为CR组和对照组，每组6只(实验过程对照组1只因取材失败而丧失数据)，CR组予正常饮食热量的60％，对照组予正常饮食，饲养6个月。各组用质量分数2%的戊巴比妥麻醉后处死，取黄豆大小胰尾于质量分数4%的多聚甲醛固定4h，常规脱水，石蜡包埋，切片(厚4μm)。NIT-1细胞培养与实验分组及细胞倍增周期培养基：体积分数90%的DMEM(高糖/无糖)加体积分数10%的FBS(含糖4.8mmol/L)，5% CO2、37℃培养，细胞收集后液氮保存。用计数板法进行细胞计数制作生长曲线并计算细胞倍增时间。实验分组正常对照组：90%的DMEM(高糖)加10%的FBS作为培养基(培养基含糖0.45%)；CR组：90%的DMEM(无糖)加入10%的FBS作为细胞培养基培养细胞(培养基含糖0.0086%)。

　　1.2.2  免疫组化(SABC法)检测Sirt1的表达 

　　细胞用4%的多聚甲醛固定20min，体积分数0.5%的TritonX-100作用20min，PBS洗3次×5min；组织切片脱蜡后，在体积分数3%的H2O2中室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性，pH值6.0、柠檬酸缓冲液(0.01mol/L)中煮沸修复10min；质量分数2％的牛血清白蛋白(BSA)封闭30min，1抗(PBS稀释)4℃过夜，PBS洗3次×5min，生物素标记的2抗室温60min，PBS洗3次×5min，1∶100稀释的ABC试剂室温30min，PBS洗3次×5min，DAB(1∶20)显色，苏木精对比染色，流水冲洗数分钟，体积分数1%盐酸酒精分化数秒，梯度酒精脱水，中性树脂封固，显微镜下观察并拍照。胰岛素免疫组化用SP法(免去ABC步骤，其它同SABC法)。PBS代替1抗作阴性对照。β-半乳糖苷酶(β-Gal)染色：切取胰腺或胰尾在新鲜配制的4%多聚甲醛中室温下固定15～20min，在新鲜配制的β-Gal染液中，37℃孵育24h；4%多聚甲醛固定12h后，脱水，石蜡包埋，切片(厚度4μm)；质量分数1%的核固红对比染色胞核。

　　1.2.3  总RNA提取 

　　用TIANGEN公司吸附柱型总RNA提取试剂盒提取总RNA，分光光度计测RNA浓度。

　　1.2.4  RT-PCR 

　　用TIANGEN公司cDNA第一链合成试剂盒，20μL反转录合成系统合成cDNA第一链；用TIANGEN公司PCR试剂盒25μL反应系统，用cDNA模板进行PCR扩增，PCR程序：94℃ 3min；94℃ 30s→58～60℃ 30s→72℃ 1min(以上循环34次)；72℃ 6min。

　　1.2.5  凝胶电泳 

　　5μL PCR产物加1μL 6×DNA loading buffer，60V电泳30min。用凝胶成像系统观察并拍照。

　　1.2.6  放射免疫测定 

　　用北京北方生物技术研究所生产的胰岛素放射免疫分析药盒，利用均相竞争抑制原理，采用平衡竞争法对细胞培养液直接测定胰岛素浓度，检测NIT-1细胞的胰岛素分泌量及量的变化。每个样品细胞接种数目一致，在加入各种诱导药物前更换细胞培养液，更换时间一致。

　　1.2.7  免疫组化图像采集和分析 
　
　　应用BX-51型显微镜(Olympu公司，日本)观察并拍照，在经免疫组化的每一标本玻片上随机取5个视野，Simple PCI软件对Sirt1及insulin染色摄片并行灰度分析，取各区域平均灰度值作为该视野目的蛋白染色灰度值后统计分析。

　　1.2.8  RT-PCR图像分析 

　　以18S　mRNA(18S)作为内参照，用GIS凝胶图像处理系统(上海天能科技有限公司，，版本：3.74)，GIS密度分析软件测定目的条带的平均光密度值，再与18S条带测得的光密度值相比，用算得的比值进行统计分析。

　　1.3  统计学处理

    采用SPSS11.5软件进行校正配对t检验，数值以x±s表示。

　　2  结果

　　2.1  CR对大鼠胰岛寿命及NIT-1细胞倍增时间的影响

    CR组NIT-1细胞倍增时间延迟21.6%(P＜0.05，图1)，CR组β-Gal染色平均灰度值明显减低［P<0.01，图2(封3)，表1］。表1  β-Gal染色及Sirt1、insulin免疫组化灰度值分析（略）

　　2.2  CR对大鼠胰岛及NIT-1细胞Sirt1表达的影响

    CR组胰岛及NIT-1细胞中均可见Sirt1高表达［P＜0.01，图3、5(封3)，表1］。在RNA水平亦可见NIT-1细胞中Sirt1高表达(P＜0.01，图6、7)。

　　2.3  CR对大鼠胰岛及NIT-1细胞胰岛素的表达及分泌功能的影响
   
　　在组织与细胞标本中，免疫组化均可见胰岛素在胞浆中表达，与对照组比，CR组胰岛素表达量均明显下降［P＜0.01，图4、5(封3)］；用放射免疫法检测NIT-1细胞各组胰岛素的分泌量，可见CR处理的细胞胰岛素分泌量明显减少(P＜0.05，图8)。

　　3  讨论

    在哺乳动物，CR能减少机体脂肪，提高胰岛素敏感性，延长寿命，在适应CR的过程中，脂肪从白色脂肪组织(WAT)中被动员出来，以最小的脂肪储存量来支持脂肪细胞［6］，为机体代谢过程带来益处①能量摄入减少可使循环糖量减少，降低胰岛素的需要量；②WAT分泌物质的改变可使胰岛素敏感性增加；③脂肪酸被氧化代谢加以利用，减少胰岛素抵抗；这些都说明CR与糖尿病密切相关。业已证实CR使Sirt1转录水平增加［7］，而Sirt1与多种细胞代谢密切相关，如可下调类固醇受体PPAP-γ并触发脂解作用，从而使脂肪从WAT中被代谢动员入血［6］，推动游离脂肪酸的代谢，减少胰岛素抵抗［8］；催化葡萄糖生成的关键转录因子PGC-1α去乙酰化而调节糖异生和糖酵解途径［9］。可见CR及Sirt1不仅影响细胞寿命，还参与了糖脂代谢。
   
　　我们以SD大鼠及β瘤细胞NIT-1作为研究对象，发现CR可延缓大鼠胰岛的衰老，并可使NIT-1细胞的倍增时间延长，胰岛中Sirt1表达增加，在培养的细胞中亦发现了Sirt1蛋白及Sirt1mRNA转录明显增加，这些都说明了CR能延长β细胞的寿命，并与Sirt1有关，与结论相同［7］。在免疫组化中发现，CR组胰岛及NIT-1细胞胰岛素表达量均明显减少，用放免法测定NIT-1细胞胰岛素分泌量的实验中亦发现，CR组细胞胰岛素分泌量明显减少，胰岛素信号的传导包括2条主要通路：丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路和PI3-K通路，insulin信号可使细胞分裂加快，寿命缩短［10,11］，CR可使循环糖量减少从而缓解糖对胰岛的过度刺激，减少不必要的胰岛素分泌，即减少胰岛素信号，延缓细胞衰老，这可能有利于保持胰岛β细胞的功能，所以这可能是CR延缓衰老的另一路径。在让β细胞特异性地高表达Sirt1的转基因小鼠中发现，小鼠的糖耐量增加了，β细胞寿命延长且功能得以保持［12］；而我们综合体内、外实验结果，发现CR使Sirt1高表达也能达到类似［12］对胰岛β细胞胰岛素分泌功能的影响结果。综上可见，CR诱导的Sirt1高表达参与了对大鼠胰岛及NIT-1细胞寿命、胰岛素的分泌功能及胰岛素抵抗等的调控作用；这些均为T2DM的发病机制提供了实验依据，并有利于T2DM的防治。

【文献】
  　　［1］Lin SJ, Defossez PA, Guarente L. Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae［J］. Science, 2000, 289(5 487): 2 062-2 063.

　　［2］广东省糖尿病流行病学调查协作组. 广东省糖尿病患病现况分析［J］. 广东医学, 2001, 22(6): 455-458.

　　［3］Shore D, Squire M, Nasmyth KA. Characterization of two genes required for the position-effect control of yeast mating-type genes［J］. EMBO J, 1984, 3(12): 2 817-2 823.

　　［4］Imai S, Armstrong CM, Kaeberlein M，et al. Transcriptional silencing and longevity protein SIR2 is an NAD-dependent histone deacetylase［J］. Nature, 2000, 403: 795-800.

　　［5］Kaeberlein M, McVey M, Guarente L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms［J］. Genes Dev, 1999, 13(19): 2 570-2 580.

　　［6］Picard F, Kurtev M, Chung N， et al. SIRT1 promotes fat mobilization in white adipocytes by repressing PPAR-γ［J］. Nature, 2004, 429: 771-776.

　　［7］Lin SJ, Kaeberlein M, Andalis AA, et al. Calorie restriction extends Saccharomyces cerevisiae lifespan by increasing respiration［J］. Nature, 2002, 418: 344-348.

　　［8］Combs TP, Berg AH, Rajala MW, et al. Sexual differentiation, pregnancy, calorie restriction, and aging affect the adipocyte-specific secretory protein adiponectin［J］. Diabetes, 2003, 52: 268-276.

　　［9］Rodgers JT, Lerin C, Haas W, et al. Nutrient control of glucose homeostasis through a complex of PGC-1alpha and SIRT1［J］. Nature, 2005, 434: 113-118.

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　　［12］Moynihan KA, Grimm AA, Plueger MM. Increased dosage of mammalian SIR2 in pancreatic beta cells enhances glucose-stimulated insulin secretion in mice［J］. Cell Metab, 2005, 2(2): 105-117.