长期低硒、低碘对子代发育期大鼠甲状腺形态结构及PCNA表达的影响

【摘要】  目的：研究长期低硒、低碘饲料喂养对子代发育期大鼠甲状腺组织形态结构以及PCNA表达的影响。方法：选取人工低硒、低碘饲料喂养繁殖的SD大鼠模型的仔3代胎鼠(F3E)、4日龄(F3P4)、21日龄(F3P21)、成年(F3A)4个时间点的甲状腺石蜡标本，常规切片，苏木精_伊红染色，免疫组化染色，镜下观察，滤泡计数。动物模型分为对照组，低硒(Se-)组，低碘(I-)组和低硒、低碘(Se-I-)组，各组分别喂以不同硒、碘水平的人工配制饲料，繁衍至仔4代。取甲状腺，制做石蜡切片。结果：各发育期时间点I-组与Se-I-组甲状腺体积增大，重量增加，滤泡增生，排列紧密。这种增生现象从胎鼠期间即有出现。在成年大鼠Se-组甲状腺滤泡有坏死和纤维化。PCNA在Se-I-组与I-组均强阳性表达，强阳性表达百分比依次为成年Se-I-组50%，I-组28?6%。21d Se-I-组21?4%，I-组16?7%。结论：低碘和低硒、低碘均可致仔代发育期大鼠甲状腺滤泡明显增生。这种增生现象在胚胎期即表现。低硒能引起部分仔代大鼠甲状腺滤泡的坏死与纤维化。

【关键词】  大鼠 缺硒 缺碘 甲状腺

    ［Abstract］Objective: To study the effects of longtime selenium(Se)and iodine(I)deficiency on histomorphology and PCNA expression of thyroid gland of rat at development stage. Methods: The paraffin specimens of thyroid gland of the third generation rats with the age of embryo(F3E), 4 days(F3P4), 21 days(F2P21), adult(F3A) as four time points of research subjects were chosen. The sections of paraffin specimens were hematoxylin_eosin stained and immunohistochemistry stained, and then observed under microscope. The follicles were counted under microscope. Healthy SD rats were divided into control group, Se_deficient group(Se- group), I_deficient group(I-group) and both Se_and I_deficient group(Se- I- group). The rats in each group were given the artificial feeds containing different levels of Se and I. These rats were bred to the fourth generation. Results: At each research time points, the goiter was produced in I- group and Se-I- group and the thyroid weight and volume were increased between two groups. Under microscope, the features of small follicular proliferation were observed. The number and density of follicles were increased. The volume of follicles, the surface and the thyroid colloid of follicle cavity were decreased. These features were observed in I- group and Se-I- group of each time points. The follicular necrosis and fibrosis were observed in Se- group of adult rat. The strong expression of PCNA occurred in Se-I- group and Se- group, Se-I- group 50?0%, I- group 28?6% in adult, Se-I-21?4%, I-16?7% in 21_day. Conclusion: Simple selenium deficiency does not induce the thyroid follicular proliferation. Simple iodine deficiency and both selenium and iodine deficiency greatly induce the thyroid follicular proliferation.

    ［Key Words］rat; selenium deficiency; iodine deficiency; thyroid gland

    硒、碘是人体发育所必须的微量元素［1］。适量碘摄入是维持甲状腺正常形态与功能的重要条件。硒通过硒蛋白参与甲状腺素的代谢及甲状腺的抗氧化过程［2～5］。以往的硒、碘缺乏对甲状腺形态结构的影响多以原代的成年动物模型为研究对象［6,7］。而对长期硒、碘缺乏动物其仔代的甲状腺研究却少有报道。本实验观察了长期低硒、低碘喂养的第3代大鼠不同发育日龄甲状腺形态结构的改变以及增生情况，以探讨低硒、低碘对仔代发育期大鼠甲状腺形态结构的影响。

    1 材料与方法

    1?1实验动物分组及样品制备选取本课题组前期成功建立的人工低硒、低碘饲料喂养繁殖的SD大鼠模型仔3代胎鼠(F3E)、4日龄(F3P4)、21日龄(F3P21)、成年(F3A)4个发育时间点的大鼠为研究对象。以健康断乳后封闭群SD大鼠为原代(F0)，每组雌雄各半，随机分为对照组［硒(0?1～0?3)μg/g，碘≥0?2μg/g］，低硒(Se-)组［硒0?02μg/g，碘≥0?2μg/g］，低碘(I-)组［硒(0?1～0?3)μg/g，碘0?04μg/g］，低硒、低碘(Se-I-)组［硒(0?01～0?02)μg/g，碘0?04μg/g］，并分别喂以不同硒、碘水平的人工配制饲料。硒以亚硒酸钠溶液，碘以碘酸钾溶液按上述剂量加入人工配制的固体饲料。大鼠自由进食，饮用去离子纯净水。每代大鼠发育至3～4月龄时开始交配，母鼠怀孕期、哺乳期饲料水平维持不变，仔鼠由母鼠哺育至21d断奶，连续繁衍至仔4代。在不同发育时间点各组大鼠断头处死，沿气管找到甲状腺，迅速取出置入体积分数10%的中性福尔马林溶液内固定，常规脱水，浸蜡，包埋，并连续切片(厚0?5μm)。

    1?2 苏木精_伊红染色、组织学观察及滤泡计数切片常规二甲苯脱蜡、梯度酒精至水，苏木精染色5min，水洗片刻，盐酸酒精分化数秒，水洗10min，饱和碳酸锂溶液数秒，水洗10min。伊红染液10s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察。在成年、21d、4d 3个时间点的每一实验组内选取5个标本，利用Qwin4?0图像分析系统(Leica公司，德国)每一标本选取5个200倍镜下视野进行滤泡计数，求出平均值。

    1?3免疫组化染色及结果判断切片常规脱蜡至水，体积分数3%的H2O2室温孵育10min。PBS洗5min共3次。微波修复抗原20min，室温冷却30min。PBS洗5min共3次。加入稀释的PCNA单克隆一抗(上海长岛生物公司，，编号M_0437)，4℃冰箱过夜。室温平衡5min，PBS洗3min共3次。滴加二抗，37℃恒温30min。PBS洗5min共3次。DAB显色，脱水，透明，封固。PCNA阳性反应细胞为细胞核着色，应用IM50图像采集系统(Leica公司，德国)每张切片在400倍镜下随机选取5个视野观察计数阳性表达率［无阳性细胞为(－)，阳性细胞比率＜25％为(＋)， 25％～50％为(＋＋)， 50％～75%为(＋＋＋)，>75%为(＋＋＋＋)］。

    1?4  主要仪器与试剂Reichert_Jung 820石蜡切片机、DMRXA2全能显微镜、Qwin 4?0图像分析系统、IM50图像采集系统(Leica公司，德国)。CH_2显微镜(Olympus公司，日本)。PCNA单克隆_抗体；HRP标记的两步法抗小鼠、抗兔检测试剂(上海长岛生物公司代理，Antibody Diagnositica公司，美国，编号D_3004)。DAB底物试剂(上海长岛生物公司，中国，编号FL_6001)。

    1?5统计学处理应用SPSS11?5统计软件分析实验结果，采用单因素方差分析以及卡方检验。
   
   2 结果

    2?1 甲状腺组织学观察不同硒、碘水平喂养的大鼠甲状腺可有不同改变。F3A：成年对照组甲状腺滤泡大小不等，周边滤泡较中央的大，腔内胶质丰富，滤泡上皮细胞呈矮立方状，部分周边滤泡上皮细胞扁平。与对照组比，Se-组镜下形态变化不明显，但部分标本有滤泡坏死纤维化的改变；I-组镜下见滤泡增多，体积小，排列密集，滤泡腔小，腔内胶质稀薄有空泡。滤泡上皮细胞呈单层立方状或柱状。滤泡间有淋巴细胞浸润、聚集。Se-I-组滤泡数量多，排列密集，滤泡腔小，甚至无腔而呈一细胞团，腔内胶质稀薄有空泡。滤泡上皮细胞呈立方或柱状。F3P21：21日龄的大鼠各组甲状腺镜下形态与成年组无太大差别。对照组与Se-组相似：滤泡大小不一，周边大，中间小，胶质丰富，滤泡上皮细胞呈矮立方或扁平状。Se-组无滤泡坏死和纤维化。I-组出现小滤泡增生改变，滤泡体积小，数量多，排列紧密，滤泡腔小，腔内胶质稀薄，滤泡上皮细胞呈立方或柱状。Se-I-组同样出现明显的小滤泡增生改变，滤泡小，数量多，胶质稀薄，滤泡腔小甚至无腔，呈一细胞团。滤泡上皮细胞呈立方至高柱状。F3P4：4日龄大鼠甲状腺总体呈幼稚状态，滤泡体积相对成年与21日龄小，对照组甲状腺大滤泡少见，胶质丰富，滤泡上皮细胞多呈矮立方状。Se-组与对照组相似。I-组与Se-I-组甲状腺滤泡同样呈增生状态，数量增多，体积缩小，排列紧密，滤泡腔小，有的还未形成滤泡而仅成一细胞团。F3E：胎鼠对照组甲状腺与其他日龄对照组相比呈明显幼稚状态，细胞密集，典型的滤泡少见，多数为腔小或未成腔的细胞团，已成腔的滤泡内胶质稀薄。滤泡细胞多呈立方状，滤泡间质丰富。I-组与对照组比细胞密度增大，典型的滤泡少见，细胞团增多，排列紧密。Se-组和Se-I-组胎鼠甲状腺形成的典型滤泡多于对照组与I-组，但仍然是小腔滤泡，胶质稀薄。滤泡上皮细胞呈立方状。而Se-I-组的滤泡数量明显多于Se-组，排列紧密，腔小甚至无腔，细胞聚集呈团，或仅出现小腔隙。总体来看，I-组和Se-I-组甲状腺有明显的增生现象，而Se-组和Se-I-组甲状腺滤泡发育则更明显。

    2?2滤泡计数结果各时间点内，I-组与Se-I-组滤泡计数均大于相应对照组与Se-组(P<0?05)，Se-组与对照组及I-组与Se-I-组之间无统计学意义(P>0?05)，但亦表现出Se-组大于对照组的趋势(表1)。 表1 滤泡计数结果

  
    2?3 PCNA表达情况F3A组PCNA表达情况见表2,其中各组的强阳性表达(++++)百分比分别为Se-I-组50?0％，I-组28?6％，Se-组6?25％，对照组0?0％，而Se-I-组明显高于I-组。 表2 成年大鼠甲状腺上皮PCNA表达情况P＜0?01F3P21组PCNA表达情况见表3，各组强阳性表达(++++)百分比分别为Se-I-组21?4％，I-组16?7％，Se-组0?0％，对照组0?0％，而Se-I-组明显高于I-组。 表3 21d大鼠甲状腺上皮PCNA表达情况

    3  讨论

    甲状腺增生肿大是碘缺乏病的重要病理改变之一，单纯碘缺乏导致甲状腺形态结构的变化已在人和动物体内得以证实［8～13］。研究证明缺硒在碘缺乏病中有一定的协同作用，硒缺乏影响甲状腺素的代谢，减少四碘甲状腺原氨酸(T4)向三碘甲状腺原氨酸(T3)的转化。本课题组前期研究表明低硒对仔3代大鼠甲状腺素代谢的影响更明显，这说明低硒在仔3代对甲状腺素的代谢起主要影响作用［13］。硒又是多种抗过氧化物酶活性中心的重要组成部分，硒缺乏导致甲状腺特别是滤泡上皮细胞上的多种抗过氧化物酶(如GPx、TrR等)表达减少，活性降低，造成甲状腺抗过氧化能力下降，从而加重甲状腺的损伤［2～5］。流行病学调查显示环境缺碘地区往往伴有缺硒，硒、碘缺乏地区的人口世代繁衍生息在低硒、低碘的环境里［14,15］。有研究，低硒、低碘对动物模型甲状腺的影响，但多以原代的成年动物为研究对象［6,7］，低硒、低碘同时作用对仔代甲状腺形态结构的影响鲜有报道。本文对模拟长期低硒、低碘环境而建立起来的繁衍至4代的SD大鼠模型的第3代进行研究［13］，观察长期低硒、低碘饲料喂养的仔3代4个发育时间点的大鼠甲状腺形态结构变化及细胞增殖的情况。PCNA是常用于检测细胞增殖情况的指标，有学者将其应用于高碘甲状腺肿的研究，很好地反映了滤泡上皮的增殖情况［16］。为探讨低硒能否引起或加重甲状腺的增生改变，检测PCNA在低硒、低碘大鼠发育期甲状腺的表达，以观察滤泡上皮增殖的情况。本研究显示，对照组甲状腺周边滤泡较中央大，这是大鼠甲状腺的正常表现［17］。相对于正常大鼠甲状腺，I-组与Se-I-组甲状腺在仔3代胚胎时期即有增生现象，表现为细胞密度增大，而到4d后则表现为滤泡数量增多，这种改变一直保持到成年。而Se-组在各个日龄内却无明显滤泡增生现象。这些观察结果提示，单纯的低碘能够导致明显的甲状腺滤泡增生，与报道一致［12］。虽然在组织学观察中没有发现低硒加重滤泡的增生改变，在滤泡计数方面，Se-组与对照组及Se-I-组与I-组之间无统计学意义，但Se-组滤泡数量有大于对照组的趋势。PCNA在成年和21d大鼠甲状腺中表达也表现出Se-组的强阳性多于对照组，Se-I-组的强阳性多于I-组的趋势。在成年Se-组内发现部分标本有滤泡的坏死和纤维化，这与研究结果相似［18］。这些结果都预示着低硒对甲状腺形态有一定影响。成年Se-组内部分标本滤泡的坏死和纤维化原因也许是低硒引起滤泡上皮细胞抗氧化能力下降，细胞遭到过氧化物的损伤所致。但这种现象没有在其它日龄内被发现，推测可能是低硒对甲状腺的破坏在成年期才出现形态结构上的改变。本研究还发现在胚胎时期Se-组和Se-I-组甲状腺滤泡的发育比非低硒组成熟一些，这一形态改变似乎预示着低硒因素在胚胎时期可促进滤泡的发育，而其具体机制以及这种促进作用利弊与否还有待于进一步研究。

 

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