异丙嗪对大鼠急性前脑缺血再灌注线粒体通透性转换的影响

【摘要】  目的：观察不同浓度异丙嗪对大鼠急性前脑缺血再灌注线粒体通透性转换(MPT)的影响，并从分子水平探讨其神经保护作用的机制。方法：用夹闭双侧颈总动脉再开放法制作全脑缺血模型。大鼠随机分为缺血再灌注+异丙嗪组(组)，假手术+异丙嗪组(假手术组)，缺血再灌注+NS(模型组)；术前1h静注不同浓度异丙嗪(5，15，45mg/kg)，术后6h　3组均分离前脑线粒体，用分光光度法检测MPT值。结果：模型组分别与治疗组(异丙嗪浓度为5mg/kg时)和假手术组(异丙嗪浓度为5，15mg/kg时)比较，模型组MPT值减小更为明显(P<0?01)；组内比较，异丙嗪浓度为5，15mg/kg时比浓度为45mg/kg时抑制MPT值减小的作用更为显著(P<0?05)。结论：异丙嗪能抑制缺血再灌注所致的MPT值的改变，因而可以通过阻止神经细胞线粒体的损伤发挥脑保护作用。

【关键词】  异丙嗪 缺血再灌注 脑 线粒体膜的通透性转换 神经细胞保护

   ［Abstract］Objective: To observe the effects of promethazine at different concentrations on mitochondrial permeability transition(MPT)of acute ischemia_reperfusion in rat fore_brain, and to explore the neuron_protective mechanism in mole_cular level. Methods: Acute ischemia_reperfusion models in rat brain were made by reopening both sides common carotid artery after clipping. Rats were assigned into ischemia_reperfusion with promethazine group,sham operation with prome_thazine group and ischemia_reperfusion withnormal saline group. Promethazine at different concentrations(5，15，45mg/kg)were injected one hour before operation, the mitochondria were extracted from rat fore_head 6 hours after operation. The MPT value in all the groups was determined by spectrophotometer. Results: Compared with the groups of ischemia_reperfusion with promethazine(5mg/kg)and sham operation with promethazine(5，15mg/kg), the MPT value decreased significantly in the ischemia_reperfusion with normal saline group(P<0?01). In the same group, the effect of promethazine(5，15mg/kg)was more obvious, compared with 45mg/kg(P<0?05). Conclusion: Promethazine at various concentrations can inhibit the changes of MPT value induced by ischemia_reperfusion in rat fore_brain，therefore the neuron_protective effect may be produced by preventing neuron mitochondrial impairment.

    ［Key Words］promethazine; ischemia_reperfusion, brain; mitochondrial permeability transition; protection of neuron

   研究表明，具有突出抗组胺作用的吩噻嗪类化合物异丙嗪对动物急性脑缺血再灌注损伤有保护作用，且推断与对抗脂质过氧化并减轻脑水肿有关［1］。最近发现，一系列结构相关的杂环族化合物均能阻抑线粒体通透性转换(MPT)的诱导，进一步抑制细胞死亡相关蛋白因子的释放［2］，因而对脑缺血具有保护作用。本实验通过建立大鼠急性前脑缺血模型，用差速分级离心法分离神经细胞线粒体，测定其MPT值，探讨不同浓度异丙嗪对大鼠急性前脑缺血再灌注MPT的影响，为其在缺血再灌注损伤中作为关键因素提供证据，为麻醉手术中脑保护提供可能的思路。

    1 材料与方法

    1?1动物健康一级SD大白鼠(粤北人民实验动物中心提供)50只，体质量192～210g，雌雄各半。

    1?2 试剂与仪器异丙嗪(上海禾嘉制药有限公司，)；线粒体制备试剂含蔗糖、乙二醇双(2_氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、Tris_HCl、BSA(天津市化学试剂三厂，中国)；线粒体蛋白测定试剂含碱性酮、酚试剂、标准蛋白质溶液(昆明杰辉公司，中国。国产分析纯)；琥珀酸脱氢酶试剂盒(南京建成生物公司，中国)；MPT测定液含Tris_Mops、Succicate_Tris、Oligomycin、Rotenone(Sigma公司，美国)，Ca2+(天津市化学试剂三厂，中国)；TGL_16B高速离心机(江阴保利科研器械公司，中国)；超低温冰箱(北京金辉盛业公司，中国)；UV240分光光度计(岛津公司，日本)。

    1?3模型制备大鼠模型制备见［3，4］。

    1?4动物分组大鼠随机分为假手术+异丙嗪组［假手术组，未行缺血再灌注，仅分离双侧颈动脉，不夹闭，不放血；根据术前1h分别尾静脉注射异丙嗪(5，15，45mg/kg)又分为A，B，C 3组］，缺血再灌注+NS组(模型组，制备缺血再灌注模型，术前1h尾静脉注射NS 1mL)和缺血再灌注+异丙嗪组［治疗组，制备缺血再灌注模型，根据术前1h分别尾静脉注射异丙嗪(5，15，45mg/kg)又分为A，B，C 3组］，共7组，每组6只，8只备用。

    1?5样品采集与处理大鼠术后6h迅速断头取脑，除去小脑和脑干,取前脑。采用低温差异离心法分离前脑线粒体。分离介质(pH 7?4)含0?25mol/L的蔗糖、0?01mol/L的EGTA、0?1mol/L的Tris_HCl和质量分数25%的BSA。整个过程均在0～4℃中进行。线粒体用以上介质制成悬浮液后于_70℃冰箱中保存备用。用Lowry法测定线粒体蛋白浓度(如蛋白含量偏低，标本弃用)。用琥珀酸脱氢酶试剂盒测定琥珀酸脱氢酶活性(如酶活性偏低，标本在以后的检测中弃用)。

    1?6 指标测定利用MPT增大时线粒体膜内、外渗透失衡，导致吸光度明显减少的原理，用分光光度法(反应条件：25℃，pH 7?4，线粒体蛋白质量浓度0?5mg/mL)检测MPT值。反应体系(MPT测定液)加入150μmol/L的Ca2+为激发剂，在540nm波长处测定各组不同时间点的吸光度值(MPT值)。

    1?7统计学处理所有数据用±s表示，采用SPSS13?0软件包行t检验、方差分析。

    2结果

   模型组内不同时间点的MPT值无统计学意义(P>0?05)，因此统一选取各组内作用6min时的值(因为NS各组值不同)进行组间比较。假手术组与组的组内比较见表1、2。组间比较见表3。表1假手术组不同浓度异丙嗪对MPT值的影响表2治疗组不同浓度异丙嗪对MPT值的影响 表33)P<0?01结果显示，缺血再灌注6h后，MPT值明显减小。与模型组比，假手术组与治疗组分别给予异丙嗪(5mg/kg、15mg/kg)后，两组MPT值有不同程度的提高；与假手术组比，治疗组MPT值有所下降。给予最大浓度(45mg/kg)时，假手术组与治疗组MPT值均低于模型组。

    3讨论

　　自Hunter等首次发现线粒体膜具有通透性转换(PT)的特性以来，其与神经细胞死亡的关系日益受到人们的关注。脑缺血再灌注损伤是一多因素共同参与的复杂过程，已有证据提出了线粒体在细胞死亡中是一个关键开关的观点［5］，尤其在中枢神经系统细胞死亡的胱冬肽酶依赖和非依赖途径，从线粒体内释放细胞色素C，AIF，SMAC/Diablo等蛋白因子至关重要［6］。这些蛋白因子释放的潜在机制至今仍未明了［7］。而MPT的诱导被认为是这些潜在机制之一［8］。有学者发现杂环族化合物异丙嗪在动物脑缺血模型中也能产生脑保护作用，但未进一步阐明其在神经细胞凋亡的线粒体途径中的作用及其量效关系［1］。本实验通过治疗组与假手术组之比发现，给予相同剂量的异丙嗪，在术后6h行缺血再灌注手术的大鼠前脑神经元线粒体MPT值明显减小(P<0?01)，符合缺血再灌注导致线粒体通透性转换孔(PTP)的大量开放。模型组与治疗组之比显示，前者MPT值减小更为显著(P<0?01)，提示药物可抑制PTP的大量开放，从而使神经细胞线粒体MPT值仍保持较高的水平，与国外报道相符［2］。异丙嗪具有突出的抗组胺作用，也归类为H1受体阻断药。资料表明，组胺对血脑屏障、微血管壁的通透性及脑微循环的功能具有重要的影响，内源性物质如组胺、5_羟色胺等均可造成胞内钙浓度的升高［9］。脑缺血再灌注损伤的中心环节就是胞内钙超载［10］，因此，阻断钙超载的上游环节，从理论上表明异丙嗪应具有脑缺血再灌注损伤保护作用。在同一组内，当药物质量分数增至45mg/kg时，发现其抑制MPT值减小作用反而不明显，提示高浓度异丙嗪对PTP开放的抑制作用减弱。线粒体的早期改变只是凋亡的上游途径，异丙嗪对缺血再灌注后MPT值的影响可能与其杂环类结构相关，但其确切机制还需进一步探讨。

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