基因治疗载体的研究现状

【关键词】  基因；;载体

    基因治疗是一种新的治疗手段，可用于多种疾病的治疗，包括癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病等.基因治疗通常是指将遗传物质（DNA或RNA）引入到患者的细胞中，以达到治疗疾病的目的的方法［1～3］.它是伴随着DNA重组技术的成熟而起来的新型的分子学治疗手段，是当今生物医学发展中的重大突破.1968年，美国家迈克尔·布莱泽首次在医学界提出了基因治疗的概念.1990年，美国科学家Anderson等进行了首例真正意义上的基因治疗临床试验，获得了初步成功［4］.在基因治疗过程中，基因导入系统是最关键的技术.目前，在基因导入载体方面出现了两大主流，即病毒载体系统及非病毒载体系统.本文对基因治疗载体应用的原理、种类和研究现状进行了综述.

    1  病毒载体

    外源基因进入细胞中通常需要运输工具，而病毒是在漫长的进化过程中存活下来的无细胞结构的最小、最简单的生命寄生形式.病毒通常可以高效率地进入特定的细胞，表达自身蛋白，产生新的病毒粒子，因此被改造的病毒首先成为了基因治疗的载体.病毒载体在基因治疗领域的应用广泛，约70%的治疗方案采用病毒载体［5，6］.病毒载体包括反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体及单纯疱疹病毒载体等.

    1.1  反转录病毒载体  反转录病毒属于正链RNA病毒，可高效地感染许多类型的宿主细胞，并可稳定地整合到宿主细胞基因组中，是最先被改造且应用最广泛的基因治疗载体.反转录病毒基因组长度约为10kb，含有3个最重要的基因，即gag（编码核心蛋白），pol（编码反转录酶），env（编码病毒外膜蛋白）.基因排列顺序是5′?gag?pol?env?3′，两端存在长末端重复区（LTRS），用于介导病毒的整合，env基因中含有病毒包装所必需的序列.另外，一些反转录病毒中存在原癌基因，其突变会引发癌变，当被整合到宿主细胞的原癌基因附近或插入到宿主细胞的抑癌基因中时也可引发癌变.构建反转录病毒载体多采用鼠白血病病毒（Mo?MLV），其为嗜双性病毒，既可感染鼠细胞，亦可感染人细胞.反转录病毒载体的基本成分包括：1）必需的病毒基因组分，如LTRS、病毒的包装识别信号、翻译所需的剪接识别位点及poly（A）尾等;2）高效的治疗基因，如抑癌基因及自杀基因等;3）标记基因，用于筛选;4）其他质粒必要成分.在应用上，携带外源目的基因的反转录病毒载体需要包装细胞（如ProPak及PA317细胞系）才能成为成熟的重组假病毒粒子，其原因为在构建的复制缺陷型反转录病毒载体中，外源目的基因取代了病毒的必需基因，此时病毒只有借助包装细胞提供的反式作用蛋白，才能包装产生子代重组病毒.这种子代重组病毒仅具备一次感染性，避免了在人体细胞间扩散感染，亦降低了病毒本身的致癌性及致病性.作为基因治疗载体，反转录病毒载体具有感染率高，可稳定整合表达，宿主范围广泛及对宿主毒性小等优点，但同时也存在仅感染正在分裂的细胞，可能致癌及包装外源DNA小（＜8kb）等缺陷.目前，在基础与临床研究中此类病毒载体多适用于间接体内基因治疗，特别是肿瘤的基因治疗.但重组反转录病毒的感染和转导效率较低，外源基因随机插入，可能导致突变.慢病毒载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒(HIV?1)为基础发展起来的基因治疗载体,区别于一般的反转录病毒载体，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，转移基因片段容量较大，转染所需的病毒滴度可达（1～10）7×MU/L，目的基因表达时间长，不易诱发宿主免疫反应，对淋巴细胞、神经细胞、肝细胞、心肌细胞、肌细胞和多种肿瘤细胞具有较高的转导效率［7～10］.

    1.2  腺病毒载体  腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒，在自然界分布广泛，至少存在100种以上的血清型.腺病毒基因组长度约为36kb，两端各有1个反向末端重复区，其内侧为病毒包装信号.腺病毒基因组上分布着4个早期转录元（E1,E2,E3,E4）承担调节功能，和1个晚期转录元负责结构蛋白编码.作为基因治疗的载体，腺病毒载体具有如下优点：1）基因包装容量较大，因而可插入大片段外源基因，最多可达35kb；2）感染效率高，可高效地转导不同类型的人组织细胞，体外实验转导效率接近100%转导效率；3) 可转导非分裂细胞；4) 在细胞培养物中有高滴度的重组病毒产量；5）进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，因而安全性较高.第一代腺病毒载体为E1或E3基因缺失，缺失区插入外源治疗基因，但此型载体可引发机体产生强烈的炎症反应或免疫反应，且表达外源基因的时间较短.第二代腺病毒载体则另外让E2a或E4基因缺失，产生较弱的免疫反应，在载体容量和安全性方面亦有较大改进.第三代腺病毒载体缺失了全部的（无病毒载体）或大部分腺病毒基因（微型腺病毒载体），仅保留反向末端重复区和包装信号序列，最多可插入35kb的基因，且所引起的细胞免疫反应更弱，在它的载体中引入核基质附着区基因可使外源基因保持长期表达，并可增加稳定性.

    1.3  腺相关病毒载体  腺相关病毒属于非致病性的微小病毒科家族成员，只有依赖于辅助病毒才可能增殖.腺相关病毒基因组很小，如2型腺相关病毒是由4681个核苷酸组成的单链DNA，包含2个基因，即rep基因（编码负责调节病毒复制、结构基因表达和整合到宿主基因组中的蛋白）及cap基因（编码衣壳结构蛋白），基因组的1个末端存在1个145bp的末端重复区.腺相关病毒可感染分裂期及静止期细胞,能插入到宿主细胞染色体内,或以染色体外串联体DNA的形式长期稳定表达，可有效地转导脑、骨骼肌及肝脏等类型的细胞，具有抗原性、毒性小及不致病等特点，被认为是目前最好的载体，在遗传病的基因治疗方面显示出优势，也被广泛应用于治疗恶性肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病及器官移植和组织细胞工程研究等［11，12］.但腺相关病毒载体存在着不能插入较大的外源基因，缺少高效的包装细胞，制备过程复杂及制备滴度低等缺陷.

    1.4  单纯疱疹病毒载体  Ⅰ型单纯疱疹病毒属于人嗜神经病毒，可在神经元内呈潜伏感染状态.Ⅰ型单纯疱疹病毒基因组为152kb大小的线性双链DNA分子，已鉴定了80个以上的基因，其中50％左右为非必需基因.野生型病毒感染神经元后，通常处于潜伏感染状态，它的基因组以附加体的形式位于细胞核内，且不被人体免疫系统所识别，潜伏期可持续至终生.当受到生理性损伤或周围神经损伤等刺激后，潜伏的人单纯疱疹病毒可被激活，进入裂解性感染期.Ⅰ型单纯疱疹病毒可被改造为2类载体：扩增子载体仅把Ⅰ型单纯疱疹病毒的复制起点和包装信号序列插入到细菌质粒中，当其转染至包装细胞后，用Ⅰ型单纯疱疹病毒辅助病毒超感染，便可获得含有扩增子的假病毒；重组Ⅰ型单纯疱疹病毒，可删除与复制相关及非必需基因，减少细胞毒性，可在宿主神经元中长期表达外源基因，但如果宿主神经元内已潜伏了野生型单纯疱疹病毒，则其可能被重新激活，继而进入裂解期.美国哈佛大学姚丰博士利用病毒自身的反式主要负调节物构建了既可抑制自身病毒复制，又可抑制野生型病毒复制的重组病毒.此病毒可作为新型、安全性单纯疱疹病毒载体，应用于临床实验研究.Ⅰ型单纯疱疹病毒载体不仅感染神经元，亦可感染非神经细胞，如上皮细胞.目前，Ⅰ型单纯疱疹病毒载体已被临床试验于恶性间皮瘤及帕金森综合症等疾病的治疗.

    2  非病毒载体

    虽然病毒载体作为基因传递的工具被广泛地采纳，但仍存在着局限性，即病毒性载体均可诱导机体产生某种程度的免疫反应，存在着插入突变等致瘤及致毒的风险，且载体容量有限，制备滴度不高等.而非病毒载体则具有无传染性，不限制载体容量，可大量制备及具有靶向性等优点［13］.目前，所应用的非病毒DNA转移方法有4种，即裸DNA、脂质体、多聚物及分子耦联体.裸DNA可将携带外源基因的质粒直接注射或通过基因枪导入到组织细胞中，主要应用于DNA疫苗，可激发机体的细胞免疫和体液免疫.脂质体是由脂质双分子层组成的颗粒，可介导基因穿过细胞膜.最常用的脂质体为阳离子脂质体，主要由带正电荷的脂类及中性辅助脂类以等摩尔混合而成.带阳性电荷的脂质体与带阴性电荷的DNA之间可有效地形成复合物，并通过内吞作用移入细胞内.多聚物，即利用阳离子多聚体，如多聚左旋赖氨酸上的正电荷与DNA上的负电荷结合发生电性中和胍，而形成稳定的多聚物/DNA复合物.复合物仍带正电荷，可与细胞表面带负电荷的受体结合，而被渗入至细胞内.分子耦联体是将外源性DNA通过某种方式共价结合到细胞表面特异受体的配基或单克隆抗体或病毒胞膜蛋白上，利用特异的结合特性介导外源性基因导入至某一类型细胞中.目前，所知的临床研究方案中，脂质体是除反转录病毒载体外应用最广泛的基因传递方法，特别在肿瘤及囊性纤维化等疾病的治疗中应用较多.尽管非病毒载体可避免引起病毒载体所带来的毒副作用，但质粒DNA和脂质体复合物与腺病毒一样，也可引发炎症.非病毒载体易于制备，并能形成规模生产，但基因转移和表达效率较低仍是困扰它的主要障碍.最近研究结果表明，超声波有助于提高质粒的转移效率.超声波配合微泡回声比差剂可提高细胞膜的通透性，从而显著提高裸DNA的转移和表达效率.这项胞膜渗透技术可在细胞膜表面瞬间制造小孔，DNA则趁机进入细胞内.尽管基因治疗载体研究已经取得众多成果，但仍需进一步努力解决基因治疗所面临的最棘手的基因导入系统问题.

【】
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