肝脏移植术探索―乙肝的免疫诊疗

　　免疫学称得上是生命的前沿学科，其发展日新月异，现已成为一门独立的学科，并广泛渗透到其他基础医学和临床医学的领域之中。而肝脏疾病的诊断和是目前临床面临的重要问题之一,不断提高肝脏疾病免疫学诊疗的质量,可为临床提供必要的诊疗指标。
　　一、乙肝免疫治疗的病理分析
　　乙肝病毒在全球有将近4亿的感染者，每年发生与乙肝相关的肝硬化和肝癌而导致的死亡人数在一百万以上，其数目骇人听闻。现阶段，对乙肝病毒理想的治疗方法应该是激活足够的免疫细胞，尽可能减少肝细胞的损伤，并能中止这种持续的感染。免疫治疗前患者体内抗原与前体DC系统的亲和积处于平衡改造状态，平衡常数L1q1L2q2＝K，假设从体外补给A的替代物对患者进行治疗，其浓度为△X，免疫治疗效果C的增加浓度为N。由于B的群体中个体的亲和力呈正态分布，所以认为B数量的减小倍数等于平均亲和力的减小倍数，假设C的生理流量不受影响，q1不变，那么，N＝L2{1-[L1/（L1＋△X）]1/2},当L1越小, 由于L1q1L2q2＝K，所以L2越大，并且当△X越大时，N越大。所以免疫治疗要大剂量给药，同时大剂量给药活化势越大，活化速度也就越大。免疫治疗需先降低血液中HBV-DNA水平，所以有必要使用核苷类似物使L1减小，同时为了加速L2的增大，可能有使用免疫或血液系统兴奋剂的必要。又成熟DC数量＝N×发生体积，所以有静脉给药或者多点皮下给药的必要。在慢性乙肝病人体内，由于存在静息活化平衡常数，那么在抗原浓度和亲和力相同的情况下，前体DC的浓度和亲和力之积为定值。前体DC浓度越大，亲和力越小，此时给药的途径的区别大大缩小。
　　乙肝病毒的各种抗原都对促进细胞免疫和体液免疫有作用。拉米夫定能使乙肝病毒各种抗原的表达都有不同程度的降低，从而能降低抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）；乙肝病毒能通过提高肿瘤坏死因子相关的调亡诱导受体和死亡受体4的表达而增强肿瘤坏死因子相关的调亡诱导配体毒性，人肝细胞中HBV复制水平升高能增强肿瘤坏死因子相关的调亡诱导配体诱导的调亡；HBV感染时肝细胞可强表达CD95L和CD95，相互作用可引起肝细胞调亡。所以拉米夫定的使用能减少肝细胞的调亡。拉米夫定治疗还能降低淋巴细胞的调亡敏感性，并且拉米夫定不会妨碍免疫系统对乙肝病毒的成功清除。在治疗的过程中可以有选择地予以护肝防纤维化治疗。
　　持续存在的乙肝病毒抗原对其敏感的前体DC持续的反向选择，使得这些前体DC不能在同一段时间内积累，继而使得二者相互作用后产生的成熟的活化的DC不能在同一段时间内积累，以致不能同时产生足够的CTL细胞进行有效的控制被感染的肝细胞的作用。所以有必要提前降低病人细胞外液中慢性乙肝抗原的含量，以减小它们的反向选择作用。界中生物对有限的资源同样存在着相互的竞争。各种免疫细胞以及它们的亚群之间均存在着相互的竞争和抑制作用，如T细胞、NK和NKT细胞之间以及它们亚群之间的相互竞争。人体各种前体DC细胞亚群之间也同样可能存在不同种群之间的相互竞争。乙肝病毒抗原系统对对其敏感的前体DC持续的反向选择，使得这些敏感的前体DC减少，进而使得它对其它前体DC细胞的抑制作用减弱，其它的前体DC细胞数量就会增加，进而增强了它们对对乙肝病毒抗原系统敏感的前体DC细胞的抑制作用，使其恢复感染前的速度减小和能恢复的数量减少。同样，被感染的肝细
胞也会持续的反向选择对其敏感的CTL细胞而使其数量减少，其它CTL细胞的数量将会增加，它们的抑制作用也会抑制乙肝病毒特异性CTL的恢复。为了增加对乙肝病毒敏感的前体DC的恢复速度，增大其能恢复的数量；同样也为了特异性抗乙肝病毒的前途CTL细胞的恢复，有必要解除这种持续的抑制作用。另外，外周血中被感染的DC细胞低水平表达MHC和共刺激分子，使得它们在与乙肝病毒特异性的T细胞群作用时，诱导活化的T细胞的比例将下降，而耐受和调节性T细胞产生的比例将升高。要解决这些错综复杂的局面，必须对免疫系统重新进行一次格式化。
　　二、肝细胞在肝脏移植免疫中的作用
　　肝脏移植相对于其他实质性大器官移植来说其术后的排斥反应相对较弱，有很多原因与此有关，肝细胞独特的生理和免疫学功能在其中可能起一定的作用，它与肝脏非实质细胞协同作用对宿主免疫系统产生影响，在一定条件下诱导移植肝免疫耐受，但也可通过上调一系列的免疫活性分子而促进排斥反应。现对肝细胞在肝脏移植免疫中的作用作一综述。
　　1、高剂量耐受的假说：最早由Bishop等提出，肝脏是实体器官移植中体积最大者，其所含的实质细胞的抗原量也最多，他们通过动物实验观察2个、3个、4个心脏（或肾脏)移植及子代(抗原量减少一半的“减体积性”）肝移植的结果，发现随着抗原量的增加，受体逐渐由排斥转为耐受。小鼠感染少量病毒会产生CTL并清除病毒，相反大量的病毒将会快速激活并随后消除病毒特异性T细胞，导致病毒持续存在，此现象称为耗竭所致的耐受（tolerance by exhaustion）。类似的现象在蛋白抗原也存在。但是高剂量耐受并不能解释移植肝耐受的全部。单是大量的肝实质细胞本身不足以诱导高剂量耐受，供者过客白细胞（donor passage leukocytes，DPLs）也起重要作用。
　　2、小体积供肝移植增加术后排斥：肝实质量明显减少的小体积供肝（如40%减体积肝移植，reduced-size orthotopic liver transplantation，ROLT）其排斥反应明显高于全肝移植的动物，存活率也明显低于全肝移植。移植肝损伤所致的早期巨噬细胞（MΦ）的激活可能在促进急性排斥中起重要作用，40% ROLT的动物移植术后浸润至门静脉周围的MΦ数量明显高于全肝移植，同时其IL-1β、IL-2、IL-10和IFNγ的mRNA水平明显上调，而给予水杨酸钠后，上述细胞因子明显减少；体外实验也证实IL-1β刺激MΦ后其CD80、CD86和CD11b表达明显增高，而这种上调可被水杨酸钠所阻断。但在婴儿肝移植中发现，当移植肝较大时，如移植肝与受体体重之比（graft-to recipicet weight ratio，GRWR）≥5%的受体，其急性排斥反应却较高，Kasahara等比较GRWR＜5%和GRWR≥5%的两组婴儿肝移植结果，也发现前者急性排斥的发生率为20%（2/10），而后者为50%（9/18）。这可能与大体积供肝（GRWR≥5%）使其相对于体重的抗原暴露量较大有关；其次，大体积供肝易受狭小腹腔的压迫致血流灌注不良、损伤较重，而移植肝损伤越重、则宿主对其免疫应答(排斥反应)也越重。
　　在小肠移植实验中，发现原位移植全小肠（70cm）比移植节段小肠（15cm）的动物存活时间更长，节段小肠移植的动物因排斥反应致死的时间明显短于全小肠移植，组织学证实其排斥反应更严重。全小肠移植的小肠实质细胞－肠上皮细胞的量要明显高于节段小肠移植，但其排斥反应却反而降低，在上述实验中发现周围血中供体来源的DPLs在全小肠移植的受体要明显高于节段小肠移植，这可能也是使其排斥降低的原因之一。 
　　3、可溶性MHC-Ⅰ类抗原：肝实质细胞产生大量的可溶性MHC-Ⅰ类抗原（soluble MHC class Ⅰ antigen，sMHC-Ⅰ）可能与肝移植的免疫抑制有关。sMHC-Ⅰ类分子能和CTL相互作用，从而抑制同种异体反应特异性的CTL，有研究发现sMHC-Ⅰ类分子能在体外诱导特异性CTL凋亡。肝细胞分泌的MHC-Ⅰ类分子能消除前体CTL对一些同种异体抗原膜结合的敏感性，从而具有潜在的免疫下调功能。运用供者肝细胞的分泌型或膜结合型MHC-Ⅰ类分子构建脂质体质粒，通过门静脉注入受鼠，结果较高剂量的分泌型MHC-Ⅰ类分子注入组移植肝存活明显延长，而膜结合型的供者MHC-Ⅰ分子却激活CTL活性。因此，肝脏实质细胞的量在肝移植免疫耐受中起一定作用，但其单独本身可能并不能直接诱导耐受，过客白细胞在其中也起重要作用，但两者确切的作用机制还需进一步的实验研究来证实。
　　三、移植肝的肝细胞对宿主免疫反应的影响
　　移植肝的肝细胞既有免疫原性也具有耐受原性，它与其他肝非实质细胞协同对宿主免疫系统产生影响。T细胞的激活一般需在淋巴样组织中经过与抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APCs）接触、提呈MHC和抗原后才可完成。但肝细胞在某些情况下也可起APCs样的作用。应用只在肝细胞上表达MHC-Ⅰ类分子Kb的转基因小鼠(可自发接受Kb+的移植物)和TCR转基因小鼠（TCR只识别未接触的、而不是经过处理的Kb抗原），研究发现：（1）高剂量的Kb抗原(肝细胞)接触可完全下调CD8+ T细胞上的TCR和CD8分子而诱导耐受。（2）同时表达自身抗原IL-2和Kb的细胞可逆转原已建立的移植物耐受，而单独的IL-2或IL-2和Kb表达的细胞分别接种于小鼠的不同部分，则仍不能打破原已建立的耐受。但在Kb+表达的肝脏，却未发现对移植物的自身攻击现象。因Kb抗原不能移行至淋巴结，T细胞只能在肝细胞上识别Kb抗原，这说明在肝细胞也可上调黏附分子和共刺激分子，表现为APCs样的表型，从而激活遭遇Kb抗原的CD8+ T细胞，但肝细胞这种APCs样的表型与专职的APCs如树突状细胞有何不同现仍不清楚。（3）肝细胞在“应激”诱导后可上调黏附分子ICAM-1和VAP-1（vascular adhesion protein-1），增强肝移植后的急性排斥反应；表达E-钙黏素和肝小肠钙黏素（liver-intestinal cadherin）、幕集周围血白细胞向肝脏积聚，产生免疫应答。（4）肝细胞在病原体或炎症性细胞因子刺激时可表达Toll样受体，通过树突状细胞和T辅助细胞1免疫应答、激活幼稚T细胞产生同种异体免疫反应。（5）肝细胞受炎症或应激刺激后可产生多种的细胞因子、趋化因子和过敏毒素，可幕集和激活宿主免疫细胞、产生炎症或排斥反应。因此，肝细胞既可诱导耐受，也可激活免疫活性细胞造成破坏性的免疫应答，但是肝细胞如何在免疫原性和耐受原性之间进行调节的机制仍不清楚。
　　此外，肝细胞与肝窦内皮细胞（sinusoidal endothelial cells，SECs）相互作用，通过调节SECs上黏附分子（ICAM-1、血管细胞黏附分子-1、E-钙黏素）的表达和功能，可放大淋巴细胞幕集通过肝窦的作用，这种旁分泌的相互作用支持着周围血淋巴细胞幕集至肝脏构成肝淋巴细胞，也是肝脏炎症时白细胞黏附至肝窦的主要类型。 　　四、肝细胞的增殖再生潜能可减轻排斥反应
　　肝脏具有强大的再生潜能，当肝实质细胞受损或丢失后，周围正常的肝细胞迅速增殖以修复所受的损伤，这种作用可明显减轻肝脏因损伤（特异性免疫反应或非特异性的缺血再灌注等）而引起的肝功能下降。因为肝细胞损伤越重，则宿主对其免疫应答（排斥反应）也越重。而肝再生可减轻肝移植中的肝损伤，就可减轻移植后的排斥反应。Matzinger提出的“危险模式”理论也可部分解释这种现象。此理论认为免疫系统可识别有无危险信号，危险信号促进静息的APCs活化、递呈抗原、产生免疫反应；而无危险信号时，T细胞对抗原产生耐受。在器官移植中，由于移植手术、移植肝损伤等产生“危险信号”，活化APCs，从而激活T细胞、破坏移植物。若移植物质量较大、血供好，修复再生能力强(如肝脏)，则移植肝的损伤可通过再生修复而不提供危险信号，这样APCs就不能活化提供第二信号，从而使T细胞耐受。虽然这一学说与临床上的损伤重的移植肝其排斥反应越强相吻合，也能部分解释肝脏“免疫特惠”的原因，但其是否是普遍性仍需进一步验证。
　　五、肝移植术后的一般处理：
　　1、饮食：在胃肠功能未恢复前应禁食，只有少量药物如晓悉等可经胃管管饲，一旦 胃肠功能恢复应尽早进食。
　　2、体位：术后早期一般以平卧位为主。护理时动作要轻柔。意识清醒鼓励早期活动 ，体位改变时，需注意中心静脉压等情况的变化。
　　3、吸氧：拔除气管插管后应给予鼻导管吸氧至呼吸功能恢复正常。
　　4、各种引流管的处理：
　　（1）胃管：在应用胃管期间，定时抽吸、冲洗，并可经胃管注入一些药物,一旦肛门排气及排便即可拔除。
　　（2）尿管：保留期间定期生理盐水冲洗，生命体征稳定后可拔除。
　　（3）CVP管、动脉压管及其他有创导管：除CVP管可保留一段时间（有些可长达几周）用来维持输液外，其他各管均在血压稳定24小时后拔除。CVP管保留期间定期换药防止感染，一旦怀疑此处有感染可能立刻拔除，并将导管尖端送培养。
　　（4）腹腔引流管：在引流量减少后逐步拔除。
　　（5）T管：某些肝脏移植术后带有T管，除引流胆汁外，它尚有助于观察病况、诊断病情，有时甚至可经过T管对胆管的某些并发症进行治疗。术后胆管的胆汁均需培养，术后2－3周可行造影，无胆漏、胆道狭窄、结石和感染及出血，则夹闭T管。在有黄疽或考虑病人有感染的情况下，应放开T管，首先观察胆汁的量、颜色等，做涂片检查有否脓球及真菌袍子，同时送培养，必要时可造影检查。拔管一般应在3-6个月或更久，拔管前应做T管造影，确保无胆管并发症，同时做胆汁培养和药敏。保留期间可交替应用生理水冲洗，或根据胆汁培养结果应用相应药物冲洗。
　　（6）气管插管：移植术后相对稳定的病人一般在48小时内拔除气管插管，但是如液体过量引起肺水肿和胸腔积液、脑病引起的呼吸机无力或肺部严重感染等需延长带管时间。
　　5、维持水、电解质、酸碱平衡：
　　液体补充原则为累积损失量、额外损失量、生理需要量。但是肝移植病人病情严重，手术创伤大、时间长，液体的进出量多，对病人的生理干扰非常大，因此必须结合临床表现和各项检查结果来决定补液量的多少。通常的补液为晶体和胶体，胶体的补充需根据胶体的丢失情况、肝功能情况等补充。最常用的胶体液有全血、血浆和人血白蛋白等。我们的经验是，晶体液约占全部液量的2/3，胶体液占1/3，胶体中血浆和人血白蛋白交替使用。补液过程中需要注意电解质平衡，重点需注意高钠、低钾、低钙血症等。根据血液检测结果，进行钾、钙、镁等离子的补充。持续高血钾常提示早期肝功能不良。除此之外，微量元素也应及时补充。肝移植病人术后常出现酸碱平衡失衡现象，故必须经常进行血气分析，有异常时要查明原因。只要纠正病因，一般都能恢复正常，如病因暂时不能纠正，则需对症处理。
　　6、营养支持：
　　需要作肝移植的病人大部分都有中毒营养不良，肝移植后营养需要量很高，从腹部引流和第三间隙的蛋白丢失量也很多，因此肝移植术后病人的营养的补充非常重要。其营养的补充一般遵循两个原则，即根据肝的代谢及肝功能状况补充营养和尽早从胃肠道进食。一般每天需补充热量30Kcal/kg/d，葡萄糖与脂肪乳各补充一半热量，脂肪乳最好使用中长链及浓度较低的，这样对肝脏负担小。另外可根据肝肾功能适当补充支链或肾病氨基酸。
静脉营养要在术后36小时开始，如果病人情况稳定，可在48小时内将热量增到需要水平。 　　7、抗感染治疗：
　　（1）抗细菌治疗：一旦发生感染尽可能按照细菌培养及药敏结果选择抗生素。抗细菌药物以广谱为主，其范围应覆盖革兰阳性菌、阴性菌及厌氧菌。抗生素的选择应是对肝、肾毒性小的药物。（2）抗真菌治疗：真菌感染是肝移植术后死亡的重要原因之一，因为应用各种导管及广谱抗生素的大量使用，真菌感染率较高，大多在术后2个月内发生。应按照培养和药敏的结果进行治疗，但即使培养是阴性结果，如果出现不明原因的发热使用抗生素效果不佳时，建议加用抗真菌药物如大扶康或二性霉素B等。（3）抗病毒感染：最常见的是CMV感染，可引起移植肝的排斥反应等严重后果。肝移植术后病人应定期做CMV抗原和抗体的血清学检查，一旦发现CMV抗原阳性，如无任何症状，即病毒血症，也应使用更昔洛韦治疗，10mg/kg/day分两次静脉输液，直至病原学检查阴性为止。如患者出现靶器官的症状，使用更昔洛韦治疗，10mg/kg/day分两次静脉输液，效果不佳时可加用磷甲酸（可耐）及丙种球蛋白。CMV感染极易复发，因此使用时间最短持续两周以上。（4）其他：结核杆菌、支原体等的感染较为少见。