小檗碱对兔颈动脉血管成形术后再狭窄的影响
作者：张焕鑫, 张宏考, 王家宁, 曾凡龙, 郭凌郧, 唐慕湘
[摘 要] 目的:通过观察小檗碱对球囊损伤后兔颈动脉内膜增生与血管重塑的影响，为血管成形术后再狭窄的防治寻找新的策略。方法:日本大耳白兔40只，随机分为假手术组、模型组、小檗碱组和辛伐他汀组，除假手术组外各组均以球囊导管扩张损伤颈动脉内膜，并分别给予生理盐水、小檗碱和辛伐他汀各2.5 mg /（kg・d）腹腔注射，假手术组仅普食喂养。术后15 d取损伤颈动脉段切片，作形态学观察，利用图像分析系统测量血管新生内膜厚度（IT）、管腔面积(LA)、新生内膜面积(IA)、内弹力板围绕面积(IEL)、中膜面积(MA)、外弹力板围绕面积(EEL)。结果:血管球囊损伤后, 小檗碱组和辛伐他汀组IT、IA、IA/MA均显著小于模型组（P<0.01）。与模型组相比，小檗碱组和辛伐他汀组LA、IEL、EEL均显著增大（P<0.01）, MA则无显著性差异。结论:小檗碱可通过抑制兔颈动脉新生内膜增生与不良的血管重塑, 从而为小檗碱防治血管成形术后再狭窄提供了实验基础。[关键词] 球囊损伤；内膜增生；血管重塑；再狭窄；小檗碱；兔
Abstract:Objective To investigate the effect of berberine on intima hyperplasia and vascular remodeling after balloon withdrawal injury of Rabbit Carotid Artery and explore a novel therapeutic strategy for the prevention of restenosis after percutaneous transluminal angioplasty.Methods Fourty Japanese rabbits were allocated randomly into 4 groups: sham operation group(n=7), model group(n=11)，berberine group (n=11)and simvastatin group(n=11), which were administered respectively with Sodium chloride, Berberine and Simvastatin (2.5mg／kg.d) . Intimal Thickness（IT）, Luminal Area (LA), Intimal Area（IA）,Internal Elastic Lamina (IEL), medial area (MA) and external elastic lamina (EEL) were measured after 15 days following carotid balloon injury. Results There was a significant decrease in IT, IA, IA/MA and a significant increase in LA, IEL,EEL compared berberine group and simvastatin group with model group.Conclusion Berberine may inhibit intimal hyperplasia and detrimental vascular remodeling.
Key words：balloon withdrawal injury; intimal hyperplasia; vascular remodeling; restenosis; berberine; rabbit
经皮腔内冠状动脉成形术(Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty,PTCA)后3~6个月的再狭窄率高达30%~50%[1]，尽管支架植入可降低再狭窄的发生，但仍有15%~30%的病例发生支架内再狭窄[2]。损伤血管在术后发生内膜增生与血管重塑不良是再狭窄形成中的主要病理过程[3~4]。最近研究表明，小檗碱不仅具有抗菌作用，还是一种新型降脂药物, 对血小板聚集有明显抑制作用[5]，还有细胞学研究认为小檗碱可抑制血管平滑肌细胞的增生，但对其抗再狭窄的在体研究却未见相关报道。本实验拟通过在体观察小檗碱对球囊损伤后兔颈动脉内膜增生与血管重塑的影响，初步探讨其对兔颈动脉血管成形术后再狭窄的防治作用。
1 材料与方法
1.1 动物分组
选取健康SPF日本大耳白兔40只[武汉大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2003-0004；实验动物技术上岗证：鄂动资字第421792号]，体重2.3~2.8 kg，平均（2.6±0.2）kg，雌雄不拘，分笼喂养，自由饮水。一周后随机分为假手术组（n=7）、模型组（n=11）、小檗碱组（n=11）和辛伐他汀组（n=11）。
1.2 模型制作与分组处理
25%乌拉坦（1 g/kg）麻醉，肝素钠（200 U/kg）抗凝。暴露并游离右侧颈总、颈内和颈外动脉。于右颈总动脉近心侧距颈内、外动脉分叉4～5 cm处及右颈内动脉起始处用动脉夹夹闭，在右颈外动脉远心侧，距颈内、外动脉分叉约1 cm处结扎。于右颈外动脉结扎处近侧穿一细线备用，并剪一"V"型小口（约为管周1/3），血管钩拉起切口，直视下逆行插入球囊导管（美国Crodis公司，球囊为2.5 mm×20 mm）至动脉夹处，连接压力泵（爱尔兰Merit医疗有限公司），以5～6 atm注入肝素生理盐水扩张球囊，重复3次，每次30 s，缓慢回拉导管，逐段扩张动脉至切口处，抽空球囊，退出导管，在切口近侧结扎右颈外动脉。假手术组不行球囊扩张，余步骤同上。术后肌注青霉素80万 u/d，连续3 d，预防感染。小檗碱组予2.5 mg/（kg・d）黄连素注射液（安徽蚌埠制药厂，10 mg/支）腹腔注射，辛伐他汀组给2.5 mg/（kg・d）辛伐他汀（美国默克公司惠赠，批号FR-047）腹腔注射，模型组腹腔注射与小檗碱组等量生理盐水，假手术组仅给予普通饮食，至术后15 d实验结束。
1.3 切片制备及指标观测
术后15 d处死全部家兔，暴露并游离右侧颈总动脉，取自颈内、颈外动脉分叉以下1 cm处至4～5 cm处约2～3 cm损伤段，生理盐水冲洗后放入10%中性甲醛固定，逐级乙醇脱水，石蜡包埋，间断均匀切片(每片厚4μm)。光镜下观察受损血管组织形态学改变，采用德国Leica Q500IW型图象分析系统测定血管新生内膜厚度(Intimal Thickness，IT)、管腔面积(Luminal Area，LA)、新生内膜面积(Intimal Area，IA)、内弹力板围绕面积(Internal Elastic Lamina，IEL)、中膜面积(Medial Area，MA)和外弹力板围绕面积(External Elastic Lamina，EEL)。
1.4 统计学处理
应用SPSS11.0软件包，各组实验数据以均数±标准差（x±s）表示。各组间比较用方差分析，两组间比较用q检验。P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 实验动物情况
本实验共用日本大耳白兔40只，其中1只（辛伐他汀组）手术过程中死亡，3只（包括模型组2只，辛伐他汀组1只）行颈动脉球囊剥脱术后死亡而退出实验，剩余36只完成全部实验。
2.2 组织形态学观察
HE染色后，光镜下观察可见颈动脉壁分为内膜、中膜和外膜，三者分界清楚。内膜和中膜以波浪状的内弹力板为界，内膜为单层内皮细胞及其基质，中膜主要成分是平滑肌细胞，呈长梭形，以管腔为中心同心圆排列，中膜和外膜以外弹力板为界。假手术组颈动脉内膜平滑、无增厚，内膜下可见扁平状内皮细胞，内弹力板完整，平滑肌细胞核呈梭形（图1-a）。模型组血管内膜增生最严重，内膜修复不完整，内弹力板不连续，腔内面不光滑，可见大量平滑肌细胞由中膜向内膜迁移并增生，细胞排列紊乱，并有大量泡沫细胞及纤维结缔组织形成，内膜明显增厚（图1-b）。小檗碱组和辛伐他汀组新生内膜中的平滑肌细胞较同期模型组明显减少，泡沫细胞、纤维结缔组织较少，内皮较完整光滑，内膜增生较轻（图1-c、1-d）。
2.3 内膜增生和血管重塑的病指标测定
表1 小檗碱对球囊损伤后血管内膜增生及血管重塑的影响(略)
Table1 Effect of berberine on intimal hyperplasia and vascular remodeling after balloon injury
注：与假手术比较, △P<0.01,△△P<0.05; 与模型组比较,▲P<0.01
内膜增生和血管重塑的病理学指标测定见表1。小檗碱组和辛伐他汀组IT、IA和IA/MA均显著小于模型组（P<0.01）；模型组则均显著大于假手术组（P<0.01）。与模型组相比，小檗碱组和辛伐他汀组LA、IEL、EEL均显著增大（P<0.01），MA则无显著性差异；但模型组LA、IEL、EEL均明显大于假手术组（P<0.05）。
3 讨论
近几年国内外研究报道表明，PTCA使血管内皮细胞受损，局部血小板聚集，血管活性物质和细胞生长因子的平衡状态被打破；同时细胞外基质的合成与降解、血管弹性回缩与收缩、炎症反应及细胞凋亡不足等多种因素的影响，导致新生内膜增生和血管重塑不良，再狭窄形成。总之, 再狭窄是局部血管损伤的一种修复反应，是多种细胞因子和生长因子介导的局部血管重建和再塑，是血管平滑肌细胞增殖、迁移、凋亡及细胞基质分泌和堆积的结果，是一系列基因异常表达所引起的血管结构与功能的改变；它不仅有对球囊损伤后反应性新生内膜形成，同时也是对球囊损伤反应性冠脉重构的过程。
新生内膜增生是血管损伤后修复的普遍反应，在再狭窄形成中起着决定性作用。本实验中损伤各组颈动脉亦均有不同程度的内膜增厚，增生的内膜主要是由平滑肌细胞、大量泡沫细胞、细胞外基质及少量的纤维结缔组织构成，因此有效抑制新生内膜增生是防止再狭窄的关键环节。本研究结果显示，使用小檗碱和辛伐他汀15 d后，可显著减小损伤血管的内膜面积和厚度、降低内膜与中膜面积比率，证实了小檗碱具有显著抑制损伤血管内膜增生的作用。小檗碱能降低低密度脂蛋白[5]，并有抗脂质过氧化作用，可防止脂质在内膜的沉积，减少和抑制低密度脂蛋白氧化生成氧化型低密度脂蛋白，而氧化型低密度脂蛋白下调内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达，增加内皮素-1 mRNA的表达[6]，并损伤内皮细胞，诱导其凋亡[7]。故推测小檗碱亦可能通过降脂和抗氧化作用直接或间接抑制内膜增生。
有学者认为，损伤区域整个血管面积的改变将对再狭窄的形成有促进作用，即发生了不利的血管重塑，其主要表现为损伤血管的腔面积和外弹力板围绕面积的缩小而中膜面积不变[8]。因此，如能增加损伤血管的腔面积和外弹力板围绕面积，促使其发生有利的血管重塑，则可能有效防止再狭窄的发生与。本研究结果显示，小檗碱与辛伐他汀15 d后，腔面积和外弹力板围绕面积均显著增大，中膜面积则无显著性差异，提示小檗碱具有促进损伤血管发生有益血管重塑的作用。而内弹力板围绕面积增大致中膜变薄，考虑在内膜增殖和血管慢性回缩的同时，尚存在局灶性的代偿性扩张或被动扩张，这可能与维拉帕米抑制兔血管成形术后内膜增殖和血管重塑的机理相似[9]。
本研究结果表明，兔颈动脉球囊损伤后腹腔注射小檗碱15 d， 可有效抑制血管平滑肌细胞的增殖、迁移和细胞外基质的沉积，阻止慢性血管回缩，增加LA和EEL, 促进代偿性血管扩张，从多个环节防止新生内膜增生与不良血管重塑, 并可促进损伤血管发生有益的血管重塑。小檗碱对损伤后血管新生内膜增生和血管重塑的影响在PTCA术后早期应用有积极意义，但更长时间的影响尚需进一步研究。
[参 考 文 献]
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