耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测方法的比较
作者：李蓓， 刘晶靖， 孙竞， 范金明， 朱怡， 熊琛
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是临床院感的常见致病菌，目前用于检测的的纸片法虽然简便，但其敏感性和准确率都不太理想。而PCR扩增mecA基因对试验条件的要求又比较高。检测mecA基因编码产物PBP2a的表达将是判断金黄色葡萄球菌对甲氧西林是否耐药的最直接证据[1]。基于此基础上的快速乳胶凝集检测试剂盒在美国已经获得FDA认证，但在我国此检测方法还未普及。为了对这几种检测方法的敏感性、准确性有一个全面的了解以寻求更准确、迅速、的检测方法，本实验将对纸片检测、基因检测与蛋白质检测方法进行比较。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源：实验菌株为十堰地区2003年5月~2004年6月间住院及门诊各种临床感染样本中分离保存的52株金黄色葡萄球菌。对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 25923由军事医学院微生物流行病研究所保存。
1.1.2 药物纸片与检测试剂盒:以苯氧西林药物纸片代替甲氧西林药物纸片，购自北京卫生部生物制品鉴定所；水解酪蛋白(M-H) 琼脂为杭州天和生物有限公司产品；耐甲氧西林金葡菌快速乳胶检测试剂盒购自英国oxoid公司。
1.1.3 引物设计与合成：从GeneBank中查到金黄色葡萄球菌mecA基因的全序列， 通过Array designer软件设计相应的引物，MecA-F, 5'-CAAGATATGAAGTGGTAAATGGT-3' MecA-R,5'-ACTGCCTAATTCGAGTGCTAC-3'送上海生物工程公司合成。DNA标准分子量标准购自北京天为时代公司。
1.2 方法
1.2.1 实验菌株的确定：所有菌株均以常规方法培养分离，革兰氏染色、血浆凝固酶试验和生化试验进行鉴定，确定为金黄色葡萄球菌。
1.2.2 纸片扩散法检测:此方法为临床检验科常用方法。苯唑西林含量为1 g/ 片,平皿中M-H 琼脂厚度为4 mm ,菌液调至0.5麦氏浊度涂布于含20 g/L NaCl的M-H 平板上。在35 ℃环境下孵育24 h。抑菌直径≤10 mm即判断为耐甲氧西林菌株[2]。
1.2.3 PCR法检测：取分离、鉴定为金黄色葡萄球菌的单个菌落，用无菌生理盐水配成1个麦氏浓度，取菌悬液10 μl 100 ℃水浴10 min，15 000 rpm离心5 min后取上清5 μl作为mecA基因扩增的模板。扩增程序：94 ℃ 7 min, 94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 50 s经30个循环后，72 ℃ 7 min；扩增产物的检测：取扩增产物10 μl于1.0%琼脂糖（内含0.5 g/L溴乙啶）TBE缓冲系统进行电泳，在紫外光下检测，在533 bp出现条带样本而阴性对照无则被认为阳性。
1.2.4 快速乳胶凝集检测试剂盒检测：将大约3～5 μl（约10～20个菌落）金黄色葡萄球菌悬浮于200 μl试剂盒所带的提取液Ⅰ中，100 ℃加热3 min，室温下冷却加入25 μl提取液Ⅱ，混匀后3 000 rpm室温离心5 min，取50 μl上清液于对照圈，加入PBP2a无特异性单克隆抗体致敏的乳胶颗粒溶液25 μl，作为阴性对照；再取50 μl上清液于试验圈中，加入25 μl 的PBP2a特异性单克隆抗体致敏的乳胶颗粒溶液；摇动3 min，于自然光下观察有无凝集颗粒出现。试验圈有凝集颗粒出现的菌株为阳性。
2 结果
结果见表1，在52株临床分离出的金黄色葡萄球菌中，药物纸片法与快速乳胶凝集试验均检测出26株甲氧西林耐药的菌株，而PCR基因扩增的方法检测出28株对甲氧西林耐药的菌株，其中的26株菌三种检测方法均证明为耐甲氧西林菌株。经过χ2检验表示3种检测方法间的差异无明显意义。
表1 三种方法检测MRSA 的敏感性及特异性比较（略）
3 讨论
本研究采用的乳胶结合试验,是近2～3 年国外学者推出的检测MRSA 的新方法。其基本原理是检测细菌是否合成PBP2a 而判断细菌是否为MRSA。此方法简便、快速、准确,检测1 份标本全部用时只需15 min。对mecA 基因扩增阳性而PBP2a 检测阴性的2 株菌再次利用乳胶试剂盒进行检测,结果仍为阴性,可能与PBP2a 在这些菌株中的表达量低有关，提高待测细菌的量(挑取50个菌落)以及延长凝集反应时间(10min) 可提高阳性率,且不会因此而降低敏感性[3]。此试验虽然表明3种检测方法结果无明显差异，但这可能是由于检测的样本数量有限所造成的。PCR法被认为是耐甲氧西林金葡菌检测的"金标准"，但由于其对试验条件要求比较高而且可能出现假阳性结果而不能在一些基层开展。在实际工作中，纸片法操作比较简单，设备简单，价格便宜但可能会造成漏诊，对纸片法检测阴性的菌株再进行乳胶结合试验将是指导临床更好的选择用药、有效进行的手段。
[参 考 文 献]
[1] Hiramatsu K,Cui L,Kuroda M.The emergence and evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].Trends Microbiol,2001,9(10):486-293.
[2] Gosbell IB,Neville SA,Mercer JL,et al.Evaluation of the MRSA-Screen Test in detecting oxacillin resistance in community and hospital isolates of Staphylococcus aureus[J].Pathology,2001,33(4):493-495.
[3] National Committee for Clinical Laboratory Standards. Perform～ance standards for antimicrobial susceptibility testing[S]. Approved standard-seventh edition M100-S10(M7). Pennsylvania: NCCLS, 2000.
