人胃癌细胞SGC-7901 生长抑制作用

摘 要：目的 观察γ -生育三烯酚（γ -tocotrienol）对人胃癌细胞SGC-7901 生长抑制作用。
方法 采用离体细胞培养技术，利用细胞生长曲线，单细胞凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳等
方法，观察γ-生育三烯酚对SGC-7901 细胞生长抑制及其肿瘤细胞DNA 损伤作用。结果 γ -
生育三烯酚可明显抑制SGC-7901 细胞生长；γ-生育三烯酚可引起人胃癌细胞株SGC-7901
细胞DNA 分子的损伤,且与处理的浓度存在一定的相关性。结论 γ -生育三烯酚对SGC-7901
细胞生长有明显抑制作用，其抑制机制与参与DNA 损伤有关。
关键词：γ-生育三烯酚；人胃癌SGC-7901 细胞；单细胞凝胶电泳
中图分类号：
1. 引 言
生育三烯酚是富含于天然谷物、棕榈油中的一种植物化学物，是维生素E 的一个亚族，
在癌症的化学预防方面起着重要作用。离体实验研究表明，γ-生育三烯酚、富含生育三烯酚
的棕榈油可以诱导多种肿瘤系细胞凋亡，并且主要集中对人乳腺癌、结肠癌、肝癌等的研究
[1-4]。但生育三烯酚的抗癌作用机制至今还不十分明确,未见国外对胃癌影响的相关报道。本
文通过离体培养人胃癌SGC-7901 细胞，研究γ-生育三烯酚对肿瘤细胞中DNA 的损伤作用,
探讨γ-生育三烯酚抑制肿瘤的可能作用机制。
2. 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 仪器
ELX800 酶标仪（Bio-Tech 公司），IX 70 型荧光显微镜（Olympus），MCO-17A CO2
培养箱（SANYO 公司）等。
2.1.2 试剂
γ-生育三烯酚（γ-tocotrienol），纯度97％，购于Davos，新加坡。γ-生育三烯酚溶于无
水乙醇，终浓度为0.15％（V/V），噻唑蓝、溴化乙锭购于Sigma公司等。
2.1.3 细胞
人胃癌细胞（SGC-7901）培养 SGC-7901细胞购自北京市肿瘤研究所。该细胞在含1
％青链霉素、1％谷氨酰胺和10％胎牛血清RPMI 1640（Gibco 公司）培养液中，于37℃、5
％CO2 培养箱中培养，用0.02％EDTA消化、传代。
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2.2 方法
2.2.1 细胞生长曲线测定
将SGC-7901细胞接种于96孔培养板中，每孔10 000个细胞，培养24h 后，换成含不同浓
度 γ-生育三烯酚2％胎牛血清培养液，每个剂量设5个重复，继续培养72h和96h。于培养结
束前4h，各取培养板一块，加入MTT（1.0mg/L）20μl，培养结束后，小心吸出培养液，每
孔加 DMSO 200μl，混匀后于酶标仪波长570nm处测定吸光度A值，绘制曲线，并和绘
制细胞增殖曲线。
增殖率（IF, %）＝ [（对照组A 值－本底值）－（试验组A 值－本底值）]／（对照组
A 值－本底值）×100
2.2.2 单细胞凝胶电泳
收集溶剂对照以及阳性对照(500μmol/LH2O2，作用10min)和浓度15、30、60μmol/L的γ-
生育三烯酚作用48h的SGC-7901细胞。将PBS液配制的0.6% 正常融点琼脂糖加热溶解，取
其100μL滴加在磨砂载玻片上，用盖玻片使胶均匀展开，置4℃ 下固化5 min，然后去除盖玻
片，即第一层胶。取新制备的细胞悬液样品10 μL与0.6 %低融点琼脂糖90μL在 37℃下充分
混匀（细胞密度，镜下每视野20～30个细胞）叠加在第一层胶上，立即放上盖玻片使胶均匀
展开，4℃固化10 min，即第二层凝胶。根据需要可以加铺第三层低融点凝胶。取下盖玻片，
将凝胶载玻片浸于新配制的裂解液（2.5 mol/L NaCl、100 mmol/L Na2EDTA、10mmol/L Tris、
1%肌氨酸钠，pH 10；用前加入1% Triton X-100和10% DMSO）中，置4℃冰箱，裂解持续
时间1h。从裂解液中取出载玻片，用去离子水洗去过多的盐，小心用滤纸吸干多余水分，按
一定方向水平移入电泳槽中，将新配制的电泳缓冲液（1 mmol/L Na2EDTA和300 mmol/L
NaOH，pH 13）倒入电泳槽，液面高于载玻片2 mm，避光静置30 min。在低温避光条件下
根据不同样品的实际情况摸索出最佳电压和电流设置，电泳时间30～45min。从电泳槽中取
出玻片，用去离子水清洗，滴加50μL溴化乙锭（ethidium bromide，EB），染色5 min后，荧
光显微镜下观察结果，24 h内阅完。在荧光显微镜下，每玻片观察10个视野，出拖尾细
胞比率，用目镜测微尺测量拖尾细胞尾长。然后选择其中部分有代表性的拖尾细胞，拍照。
2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
收集60μmol/Lγ-生育三烯酚作用48h 的SGC-7901 细胞，PBS 缓冲液洗2 次，弃上清。
加入DNA 抽提液0.5mL 重悬细胞，37℃水浴60 min。加入20mg/mL 的蛋白酶K 至终浓度
100μg/mL，边加边搅拌，至溶液呈粘稠状，50℃水浴180 min。冷却至室温，加入等体积饱
和Tris-HCl 酚溶液，上下轻轻转动离心管混匀，直至水相与酚相混匀并呈乳状液。室温5 000
rpm 离心15min，使两相分开（水相在上层，酚相在下层），DNA 在水相。氯仿：异丙醇
（24：1）抽提一次，室温5 000 rpm 离心15min。将上层水相移出，加入0.1 倍体积的乙酸
钠，再加入2～3 倍体积的无水乙醇，缓慢摇匀，可以见到乳白色DNA 絮状沉淀。小心用
玻璃棒挑出絮状沉淀，用75％乙醇洗涤2 次，再加入1mL 75％乙醇，室温5 000 rpm 离心
10min。用玻璃棒挑出絮状沉淀，加入100μL TE 缓冲液，溶解DNA 沉淀。取10μL 样品与
上样缓冲液混匀，上样，1.2％琼脂糖凝胶电泳，60V，60min，在紫外激发下可观察凋亡细
胞的 DNA 片段化，并拍照。
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3. 结果
3.1 细胞生长曲线
采用MTT 试验，结果显示，在作用24 h 和和48 h 时，随γ-生育三烯酚浓度（0、10、
20、 30、 40、 50、60 和80 μmol/L）的增加，对SGC-7901 细胞的增殖率呈降低趋势，γ-
生育三烯酚作用于SGC-7901 细胞24h 和48h 的半数有效抑制率分别为61.88 ± 6.23μmol/L
和38.02 ± 3.68μmol/L。
0
0 . 2
0 . 4
0 . 6
0 . 8
1
1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 8 0
剂量（μm o l / L ）
细胞增殖率（%）
2 4 h
4 8 h
图 1. 不同浓度γ-生育三烯酚作用24 、48 小时对SGC-7901 细胞增殖的影响 (n=5)
3.2 γ-生育三烯酚诱导SGC-7901细胞DNA损伤作用
3.2.1 单细胞凝胶电泳
单细胞凝胶电泳是用来检测在外界因素作用下，引起细胞染色体DNA 损伤程度，
SGC-7901 细胞经不同浓度γ-生育三烯酚作用48h，经单细胞凝胶电泳后，EB 染色，荧光显
微镜下观察，溶剂对照组的细胞为橘红色圆形，无拖尾现象；而各实验组均出现不同程度的
橘红色彗星样拖尾细胞，并随剂量浓度的增加，拖尾愈加明显，拖尾细胞密度也越高，经
60μmol/Lγ-生育三烯酚作用48h 后，细胞拖尾率为 79.1±5.1％，平均尾长为 75.29±16.19μm；
阳性对照组细胞拖尾率为93.8±6.3，平均尾长为132.51±26.84μm。实验结果表明，γ-生育三
烯酚对SGC-7901 细胞DNA 的损伤随其剂量增大而增加。
图 2 不同浓度γ-生育三烯酚作用SGC-7901 细胞48 小时单细胞凝胶电泳图 (×200)
A：阴性对照组; B：15μmol/L; C：30μmol/L; D：60μmol/L; E: 阳性对照组
A B C D E
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表 1. 不同浓度γ-生育三烯酚作用SGC-7901 细胞48小时对DNA损伤的影响 ( ±s ,n =3)
组别 数目 拖尾率 (%) 尾长 (μm)
阴性对照组 150 6.3±0.6 8.33±2.11
15 μmol/L 150 38.1±1.3†† 24.38±3.93††
30 μmol/L 150 57.3±2.3†† 49.12±10.28††
60 μmol/L 150 79.1±5.1†† 75.29±16.19††**
阳性对照组 150 93.8±6.3†† 132.51±26.84††
† † p < 0.01, 与阴性对照组相比
** p < 0.01，与阳性对照组相比
3.2.2 琼脂糖凝胶电泳
本实验采用琼脂糖凝胶电泳观察γ-生育三烯酚抑制SGC-7901 细胞增殖过程中的肿瘤细
胞DNA 分子的变化，实验结果（实验重复3 次，结果趋势一致，采用一次的实验结果）表
明：在反应体系中加入60μmol/L 的γ-生育三烯酚作用48 h 后，琼脂糖凝胶电泳上呈现明显
的DNA 梯形图形（图3）。
图 3. 60μmol/L γ-生育三烯酚作用SGC-7901 细胞48小时琼脂糖凝胶电泳图.
4. 讨论
生育三烯酚也是维生素E 家族主要成员，与生育酚不同，生育三烯酚有一个含不饱和
键的异戊二烯链，以往维生素E 的研究主要集中在生育酚活性方面，而对生育三烯酚研究
较少。近几年研究表明生育三烯酚生物活性强于生育酚，表现在抗氧化、降血脂、神经保护
以及抑制肿瘤等方面。生育三烯酚及富含生育三烯酚的棕榈油抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡
可能通过以下作用机制[1, 5]：调节PI3P/PDK/AKT 信号转导途径参与肿瘤细胞凋亡；诱导
caspase-3 降解失活；调节Bcl 家族相关蛋白的表达等。本课题组前期研究发现[6]：γ-生育三
烯酚具有诱导人胃癌SGC-7901 细胞凋亡作用，并影响DNA 修复蛋白PARP 的活性；Raf-Erk
信号转导途径也参与肿瘤细胞凋亡过程。鉴于γ-生育三烯酚有诱导肿瘤细胞PARP 降解失活
作用，因此，本研究利用单细胞凝胶电泳与琼脂糖凝胶电泳等技术，探讨γ-生育三烯酚是否
引起肿瘤细胞DNA 的损伤以及损伤性质。γ-生育三烯酚研究结果表明：γ-生育三烯酚诱导
DNA 损伤随作用剂量的增加肿瘤细胞的拖尾率、尾长增加；DNA 梯形条带的出现说明肿瘤
细胞DNA 损伤后形成180--200bp 碱基片段，是由于细胞凋亡引起，而非DNA 的弥漫性损
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伤。提示γ-生育三烯酚可以有效抑制SGC-7901 细胞增殖，诱导DNA 损伤可能是生育三烯
酚抑制肿瘤的作用机制之一。
5. 致谢

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DNA damagement of γ-tocotrienol on human gastric
carcinoma SGC-7901 cells
Sun Wen-guang1, Liu Hui-kun2, Dong Feng-li1, Sun Xiang-rong2, Chen Bing-qing2
1 The Department of Clinic Nutrition, the First Clinical College of Harbin Medical University,
Harbin (150001)
2 The Department of Nutrition and Food Hygiene, the Public Health College of Harbin Medical
University, Harbin (150081)
Abstract
Object To investigate the effect of inhibitory growth on human gastric carcinoma SGC-7901 cells
induced by γ -tocotrienol. Methods SGC-7901 cells were treated with different γ-tocotrienol
concentrations and with a negative control. The curve of cell growth, single cell gel electrophoresis and
agarose gel electrophoresis. Results γ-Tocotrienol inhibited SGC-7901 cell growth in a concentrationand
time-dependent manner. The inhibitory effects of SGC-7901 cells was correlated with the
DNA-damage in a concentration-dependent manner at 48h. Conclusion γ-Tocotrienol could inhibit
SGC-7901 cells proliferation by the DNA-damagement. It may be an anticancer mechanism of
γ-Tocotrienol.
Keywords: γ-tocotrienol, Human gastric carcinoma SGC-7901 cells, single cell gel electrophoresis