敦煌古方“紫苏煎”对慢性支气管炎大鼠血清、肺组织中NO、ET
作者：王凤仪,贾育新,李生财,王小荣,刘峰林,楚惠媛
摘 要：目的：探讨敦煌古方“紫苏煎”慢性支气管炎的作用机制。方法：采用改良烟熏法复制慢性支气管炎大鼠模型，实验动物随机分为模型组、冲剂组、紫苏煎低剂量组、紫苏煎高剂量组及不加处理的空白对照组。造模各组以高、低剂量紫苏煎、止咳化痰冲剂和生理盐水进行干预，测定各组大鼠血清、肺组织中内皮素-1（ET1）及一氧化氮（NO）的含量。结果：模型组大鼠血清、肺组织中ET1较正常空白组明显升高（Ｐ＜0.01）；NO含量较正常空白组明显降低(Ｐ＜0.01)。与模型组比较，紫苏煎高剂量组、紫苏煎低剂量组及冲剂组血清、肺组织中ET1明显降低（Ｐ＜0.05或Ｐ＜0.01）；NO含量均明显升高（Ｐ＜0.05或Ｐ＜0.01）。与冲剂组比较，紫苏煎高剂量组血清、肺组织中ET1含量明显低于冲剂组（Ｐ＜0.05或Ｐ＜0.01）；NO含量均高于冲剂组（Ｐ＜0.05或Ｐ＜0.01）。结论：“紫苏煎”可显著提高慢性支气管炎模型大鼠的NO含量，降低ET1的含量。提示该方可以调节和保持血管、气管舒缩平衡，减轻炎症反应。
关键词：敦煌医学；紫苏煎；慢性支气管炎；ET1；NO；实验研究
敦煌古方“紫苏煎”治疗慢性支气管炎疗效肯定，但其作用机制尚不十分清楚。有研究结果表明，体内氧化―抗氧化平衡失调[1]及血管系统的舒张―收缩性失衡[2]在慢性支气管炎的形成和中具有重要作用。 本实验通过观察“紫苏煎”对慢性支气管炎大鼠血清、肺组织中内皮素-1（ET1）及一氧化氮（NO）含量的影响，进一步探讨其治疗慢性支气管炎的作用机制。
1材料
1.1动物
健康Wistar老龄大鼠52只（清洁级），质量200±20 g，雌雄各半，由甘肃中医学院实验动物中心提供，动物合格证号：医动字第235号。
1.2试剂盒
ET1试剂盒（批号：200508）、NO试剂盒（批号：20050816）均由南京建成生物工程研究所提供。
1.3药物
“紫苏煎”药剂：原方各种药材按照比例配方共计相当生药146 g，将4剂中药打成粉末，在适宜温度下渗滤、醇提，挥发酒精，平均分为4等份，其中1份浓缩成生药浓度为1 g/mL的紫苏煎液，另外3份合并浓缩成生药浓度为2.5 g/mL的紫苏煎液，分别作为低、高剂量组实验用药剂。祛痰止咳冲剂，由广州市花城制药厂出品（批号：20041013），实验时用蒸馏水配制成浓度为0.085 g/mL的混悬液使用。
2方法
2.1动物分组
采用数字表法将52只大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组、紫苏煎低剂量组及紫苏煎高剂量组，共5组。其中模型组12只，其余各组10只。
2.2动物造模
除空白对照组外，其余各组用烟熏法造模。造模参照[3]法，采用改良烟熏法复制：（1）将造模组大鼠共42只置于90 cm×60 cm×60 cm的烟室中，烟室上方开一0.4 cm×60 cm的缝隙，下面外接回活塞通气管具，通气管具活塞端接烟条，后端接50 mL注射器。（2）将锯末、旱烟条各12 g混合均匀，卷成每支8 g左右的烟条。将烟条接在活塞端，点燃烟条，抽动活塞即可顺利通入。（3）烟熏大鼠：共30 d，其中前20 d每日2次，每次30 min，每次用烟条3支，每隔10 min加入1支;后10 d每天1次，每次30 min，每次用烟条3支，每隔10 min加入1支。（4）第20 d时，取模型对照组大鼠雌雄各1只，断颈处死，取右肺中部组织在10 %福尔马林中固定，再经过脱水、浸蜡、包埋等处理，切片，常规HE染色做成病理切片光镜下观察，证明慢性支气管炎已经形成，造模成功。（5）从造模第20 d起，空白对照组不施加任何影响，模型对照组用生理盐水灌胃，阳性对照组用公开上市中成药止咳化痰冲剂灌胃，紫苏煎高剂量组、紫苏煎低剂量组用配制的高剂量、低剂量紫苏煎液灌胃。（6）用药剂量见表1、表2，冲剂组相当于临床药量的10倍，紫苏煎低剂量组相当于临床药量的5倍，紫苏煎高剂量组相当于临床药量的15倍，各组均用药20 d。
2.3检测方法
血清制备：在治疗结束后第2 d，将大鼠股动脉剪断取血8 mL左右，分为2份，每份4 mL，其中1份立即加入抗凝剂并与抗凝剂混合均匀，静置，以3500 r/min离心，移取上层血清，在-20 ℃下冻存待测。另一份立即以3500 r/min离心，移取上层血清，在-20 ℃下冻存待测。肺组织匀浆的制备：（1）大鼠取血后，立即断颈处死，剖取气管和肺脏，取左肺下叶组织0.3 g左右，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，置于小烧杯中。（2）用移液管量取0.86 %的预冷生理盐水2.7 mL（按照实际组织重量的9倍），先将2/3置于小烧杯中，用眼科剪尽快剪碎组织块。（3）将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，用剩余的1/3冷盐水冲洗小烧杯，一起倒入匀浆管中。（4）将匀浆器下端插入盛有冰水混合物的器皿中，充分研磨使组织匀浆化。（5）将制备好的匀浆以3000 r/min离心15 min，移取上清液，在-20 ℃下冻存待测。检测方法：NO采用硝酸还原化学比色法测定，ET1采用放射免疫法测定。严格按试剂盒说明检测。为了避免实验干扰因素，肺组织匀浆中所测物质含量以实测值与总蛋白比值表示。
2.4统计学处理
实验数据用SPSS 13.0统计软件处理，所有数据用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。
3结果
3.1“紫苏煎”对慢性支气管炎大鼠血清、肺组织中NO含量的影响实验结果显示：模型组大鼠血清、肺组织中NO含量较空白对照组明显降低（Ｐ＜0.01）。经用药后，紫苏煎高剂量、紫苏煎低剂量组及冲剂组血清、肺组织中NO均较模型组明显升高（Ｐ＜0.05或Ｐ＜0.01）。紫苏煎高剂量组血清、肺组织中NO较冲剂组明显升高（Ｐ＜0.05或Ｐ＜0.01），而紫苏煎低剂量组与冲剂组之间未见明显差异（Ｐ＞0.05）。见表1。（略）
3.2“紫苏煎”对慢性支气管炎大鼠血清、肺组织中ET1含量的影响实验结果显示，模型组大鼠血清、肺组织中ET1含量较空白组明显升高（Ｐ＜0.01 ）。经治疗用药后，紫苏煎高剂量组、紫苏煎低剂量组及冲剂组血清、肺组织中ET1含量均较模型组明显降低（Ｐ＜0.05或Ｐ＜0.01 ）。紫苏煎高剂量组血清、肺组织中ET1含量均低于冲剂组（Ｐ＜0.05或Ｐ＜0.01 ），而紫苏煎低剂量组与冲剂组之间没有明显差异（Ｐ＞0.05）。见表2。（略）
4讨论
4.1“紫苏煎”组方依据慢性支气管炎属于中医“咳嗽”、“痰饮”、“喘证”的范畴，其病因病机与外邪入侵和内伤有关，病位主要在肺，但与脾、肾关系也十分密切。病机以本虚标实为特点，本虚多为肺、脾、肾三脏虚损，标实多为气滞、痰凝、血瘀互结，导致病情缠绵不愈，最终形成慢性虚性病理损害。敦煌古方“紫苏煎”由十余味中药组成，方中紫苏宣肺降气为君药；款冬花润肺止咳,桑白皮泻肺平喘，两者合用共为臣药；浙贝母清热润肺、化痰止咳；酥油润肺止咳；杏仁、桔梗宣肺化痰，止咳平喘；丹参、桃仁活血化瘀；柯勒皮敛肺止咳；通草助肺通调水道；甘草调和诸药。全方共奏“补益气血，润肺止咳，化痰平喘，活血化瘀”之功，切合慢性支气管炎痰瘀为患的病机特点和该病本虚标实的病理本质。
4.2“紫苏煎”可有效调节和维持肺气道及血管的舒缩平衡，明显减轻炎症反应
一氧化氮（NO）是以精氨酸为底物在一氧化氮合酶（NOS）作用下生成的一种氮氧化合物，气道和肺的上皮细胞、内皮细胞以及炎症细胞包括肺泡巨噬细胞等均可合成和释放NO。NO不但是重要的内皮源性舒张因子，也是重要的上皮源性舒张因子，其主要功能有：使平滑肌舒张、扩张支气管、抑制血小板凝集[4]及扩张肺气管、支气管、血管、增加通气/血流比的功能[5]。而肺血管和细支气管平滑肌不仅是血管、细支气管舒缩的主要承担者，还是肺组织结构重建的主要成分。NO含量过低可造成细支气管失去正常舒张状态，造成气道充血，加重炎症反应和组织损伤。因此，生理范围内的NO对保持肺血管、细支气管的舒缩动态平衡，维持血管、细支气管的正常张力以及肺血管、细支气管的结构重建，维持肺血管、细支气管的内皮完整性均有重要意义。
内皮素（ET）是1988年由日本Yangisawa等从猪主动脉内皮细胞中分离纯化出的一种由21个氨基酸组成的血管活性多肽[6]，目前已知内皮素有ET1、ET2、ET3三种。肺内主要产生ET1，气管黏膜上皮细胞、支气管上皮细胞、浆液细胞、Clara细胞、肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞、腺体及肺拟交感神经节都有特异性ETmRNA和ET，而肺内皮细胞及非内皮细胞都有很强的ET结合能力。ET1是目前所知最强的气管和支气管平滑肌收缩剂，同时具有使血管平滑肌收缩、调节呼吸系统血流，诱导炎性介质的定向移动、促进纤维母细胞增生的生物活性作用[7] 。慢性支气管炎存在慢性炎症，其炎性介质增高，如IL2α、IL2β、INFα增加了气道上皮细胞表达PrepromRNA及ET1合成。同时，低氧亦是ET产生的主要刺激因子，慢性支气管炎所致的低氧也增加了内皮细胞的前内皮素PrepromRNA的表达[8]，故慢性支气管炎患者ET升高。而过高浓度的ET1会进一步增强气道痉挛，血管收缩，从而进一步加重了气管、血管的舒缩失衡，加重了气道炎症。故检测ET1可作为慢性支气管炎疗效的指标。
本实验显示，采用烟熏法复制的大鼠慢性支气管炎动物模型，其血清、肺组织中NO含量较空白组明显降低（Ｐ＜0.01），而ET1含量明显升高（Ｐ＜0.01）。通过模型组与空白组结果比较，说明模型组大鼠肺部慢性炎症时，由于肺泡上皮细胞损伤，合成NO能力不足，不能产生足够的NO，而使血管、支气管失去正常的舒张状态。同时，由于慢性炎症及低氧的刺激，ET1产生过量，浓度过高，导致血管进一步收缩、气道痉挛。意味着机体进入失代偿状态，血管、支气管舒缩失衡，血管、气管舒缩失衡是慢性支气管炎的重要发病机制。
用药治疗后，紫苏煎高剂量组及紫苏煎低剂量组慢性支气管炎大鼠血清、肺组织中NO含量均高于模型组（Ｐ＜0.05或Ｐ＜0.01），ET1均低于模型组（Ｐ＜0.05或Ｐ＜0.01），显示出“紫苏煎”各组药物均能提高NO含量，降低ET1的含量，防止血管收缩失去正常舒张状态、气道痉挛充血及组织损伤，维持气管及肺血管舒缩平衡，减轻气道炎症反应。另外，从实验结果可以看出，用药物治疗大鼠慢性支气管炎，对于抑制血清、肺组织中NO含量的降低及ET1的升高，紫苏煎高剂量组优于冲剂组（Ｐ＜0.05或Ｐ＜0.01），而冲剂组与紫苏煎低剂量组间无明显差异（Ｐ＞0.05）；说明“紫苏煎”治疗作用存在量效关系。
动物实验证实，当出现慢性支气管炎时，NO含量显著下降，而ET1含量显著升高，提示血清、肺组织中NO缺乏，ET1升高导致血管、气管舒缩失衡是慢性支气管炎的重要发病机制之一。而现已证实ET1和NO是由气道和肺上皮细胞以及炎症细胞包括肺泡巨噬细胞合成和释放的一对相互拮抗的生物活性因子。“紫苏煎”能显著提高慢性支气管炎大鼠NO含量，降低ET1含量，说明该药具有调节和保持肺血管、气管舒缩平衡，减轻气道炎症反应的作用。这可能是“紫苏煎”治疗慢性支气管炎的作用机制之一。
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