bFGF在辛伐他汀改善高脂血症大鼠血管内皮功能中的作用研究

                作者：王庸晋 魏 武 王治平 公慧萍 韩晓云 李启富 程晋芳   

【摘要】  目的：研究碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）在辛伐他汀改善高脂血症大鼠血管内皮功能中的作用。方法：将30只实验SD大鼠随机分为对照组、高脂血症组和组。观察不同组离体大鼠主动脉环对不同浓度乙酰胆碱(Acetylcholine，Ach)的舒张反应。应用RT-PCR和Western-blotting技术检测主动脉组织bFGF mRNA和蛋白含量表达；应用ELISA方法检测血清bFGF含量；应用硝酸酶还原法检测血清和主动脉组织一氧化氮（NO）的含量。结果：给予高脂血症SD大鼠辛伐他汀20 mg/（kg·d），持续治疗16 W后，血脂总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)浓度降低(P<0.01)，高密度脂蛋白(HDL)浓度升高(P<0.01)，其主动脉环对不同浓度Ach舒张反应百分率明显升高(P<0.05)，主动脉组织中bFGF mRNA、蛋白和NO含量以及血清bFGF和NO含量均升高(P<0.05)。结论：bFGF可能参与辛伐他汀保护血管内皮，提高NO含量，改善血管内皮舒张功能的作用。

【关键词】  高脂血症；大鼠；血管内皮功能；碱性成纤维细胞生长因子；一氧化氮

    Abstract  Objective：To investigate the role of bFGF in improving vascular endothelial function of hyperlipidemic rats with simvastatin. Methods：30 Sprague-Dawley (SD) rats were divided randomly into three groups which were control group, hyperlipidemic group (HL) and hyperlipidemic-simvastatin group (HL-SIM). We observed the relaxation of the isolated rat aorta rings in response to acetylcholine (Ach) for each group.The basic fibroblast growth factor (bFGF) mRNA expression was measured by RT-PCR and the protein content of bFGF was measured by western-blotting technique in the rat aorta tissue.ELISA and colorimetry assayed the content of serum  bFGF and nitric oxide (NO).Total cholesterol (TC),triglyceride (TG),low density lipoprotein(LDL)and high density lipoprotein (HDL) for each group were  measured.Results：This study showed that the relaxation percentage of isolated rat aorta rings, the bFGF mRNA  and bFGF protein expression in aorta tissue, and the content of serum NO and bFGF were enhanced more significantly in HL-SIM group than that of HL group(P<0.05).Coulusion:bFGF may be involved in the effects of simvastatin on improving vascular endothelial function of hyperlipidemic rats.

    Key words  Hyperlipidemia; Rat; Vascular Endothelial Function; bFGF;NO

    临床研究发现，高脂血症患者在动脉粥样斑块形成之前存在着明显的血管内皮功能障碍［１，２］，而调脂药物辛伐他汀能改善血管内皮功能障碍［３］。然而，高脂血症导致血管内皮功能障碍的机制和他汀类药物改善血管内皮功能的机制不完全清楚，是否与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）作用有关有待于进一步研究。本研究探讨了bFGF在辛伐他汀改善高脂血症大鼠血管内皮功能障碍中的作用。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  主要试剂：bFGF检测试剂盒(鼠用)购于美国Genzyme公司，血脂测定试剂盒购于北京中生生物工程高技术公司，NO检测试剂盒购于北京晶美生物工程有限公司，分子生物学试剂购于上海生工生物公司。

    1.1.2  引物设计：根据GeneBank设计，GAPDH上游引物5’-CTA CCC ACG GCA AGT TCA AT-3’，下游引物5’-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3’。扩增片段：501 bp。 bFGF上游引物5’-TTC TTT GAA CGC CTG GAG TCC-3’，下游引物5’-TTA GCA GAC ATT GGA AGA  AAC  A-3’，扩增片段156 bp。

    1.1.3  药物：辛伐他汀20 mg/片购于美国默沙东公司，乙酰胆碱和苯肾上腺素购于美国Sigma公司。

    1.1.4  动物：清洁级雄性SD大鼠30只，28周龄，体重200 g～250 g，由中南大学实验动物学部提供、饲养。用尾套式血压计检测30只大鼠的血压，血压均小于90 mmHg，并按体重依次编号后，随机分组。

    1.2  方法

    1.2.1  动物分组：实验动物分3组(n＝10)：①正常对照组，基础饲料喂养20　W；②高脂血症组，按高脂血症动物模型方法进食高脂饲料，持续20　W；③治疗组，饲养同高脂血症组，于第5　W起按20　mg/(kg·d)给予辛伐他汀，持续治疗16　W。

    1.2.2  标本的采集和处理：于第20 W末，从心脏采血提取血清，用于测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、一氧化氮(NO)和bFGF含量。同时取主动脉用于组织病理形态学检查、测定主动脉组织中bFGF蛋白含量和mRNA表达以及NO含量。

    1.2.3  三组大鼠实验前后肝、肾功能测定：三组大鼠血标本中的谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)含量的测定。

    1.2.4  血脂TC、TG、LDL、HDL浓度和血清bFGF、NO的含量测定：血脂TC、TG、LDL和HDL浓度测定方法按血脂测定试剂盒要求操作规范操作。血清中NO和bFGF含量的测定方法按试剂盒要求操作。

    1.2.5  主动脉组织NO含量测定：取主动脉组织50 mg匀浆后按试剂盒要求操作。

    1.2.6  主动脉组织bFGF含量的检测(Western-Blotting)：方法参照分子克隆实验指南［４］，按步骤完成。

    1.2.7  应用内参比法RT-PCR测定主动脉组织bFGF mRNA的表达：采用Trizol一步法，按Trizol试剂盒的说明操作，提取主动脉组织总mRNA。用紫外分光核酸蛋白分析仪测定mRNA纯度和浓度，琼脂糖凝胶电泳检查mRNA的完整性。mRNA逆转录合成cDNA，进行GAPDH与bFGF共体系PCR扩增，并进行RT-PCR产物电泳、照相及定量分析。结果判定：以在胶上肉眼能见到GAPDH、bFGF的PCR扩增带为阳性，以未见到GAPDH、bFGF的PCR扩增带为阴性。在Eagle Eye Ⅱ凝胶成像分析系统(美国)上扫描定量，读取各带的积分光密度值(IOD)，根据GAPDH、bFGF mRNA条带的IOD比值分析bFGF的表达水平。

    1.2.8  离体主动脉环舒张反应测定：各组动物给予0.1％水合氯醛麻醉后，开胸剪取胸主动脉，置于充95％ O2和5％CO2混合气体的改良Kreb’s液(mM：NaCl 115.0，KCl 4.6，MgSO4 1.16，NaH2PO4 1.16，NaCO3 21.9，CaCl2 2.5，葡萄糖11.0；pH7.4)。剪去血管周围结缔组织，清除血管内血液，剪成长度约3 cm～4 cm的血管环，一端固定于浴槽，另一端连接张力换能器，连续记录血管张力变化。血管环置于8 mL充满95％ O2和5％CO2混合气体改良Kreb’s液水浴槽中(37 ℃)，每隔15 min更换Kreb’s液一次，重新平衡。用苯肾上腺素(10-6 M)收缩血管。待稳定后观察不同浓度Ach(3×10-9～10-6M)诱导血管内皮依赖性舒张。

    1.2.9  主动脉血管壁形态学观察：各组在主动脉弓取组织5 mm制做石蜡切片，行HE染色，光镜下观察。

    1.3  统计学方法

    本实验研究在Windows操作环境下，应用SPSS 11.0软件包进行分析和检验，分别将正常对照组、高脂血症组、治疗组进行单因素方差分析，当P<0.05时，进一步作任一两均数的比较用q检验。结果用均数标准差(x±s)表示，以P<0.05判定有显著性差异。

    2  结果

    2.1.  各组实验大鼠(20 W末)血标本中ALT、LDH、BUN和Cr含量比较

    各组实验大鼠血标本中ALT、LDH、BUN和Cr含量，无显著性差异(P>0.05)，结果表明各组实验大鼠无肝、肾功能异常，见表1。

    王庸晋等.bFGF在辛伐他汀改善高脂血症大鼠血管内皮功能中的作用研究表1  各组实验大鼠血标本中ALT、LDH、BUN和Cr含量比较    (略 )三组各项指标比较P>0.05

    2.2  辛伐他汀对高脂血症大鼠血脂TC、TG、LDL和HDL浓度的影响

    本研究表明，辛伐他汀治疗高脂血症大鼠16 W后，治疗组血脂TC、TG和LDL浓度明显低于高脂血症组(P<0.01)，HDL浓度明显高于高脂血症组(P<0.01)，而与对照组相比无显著性差异(P>0.05)；高脂血症组血脂TC、TG和LDL浓度明显高于对照组(P<0.01)，而HDL浓度明显低于对照组(P<0.01)，见表2。表2  辛伐他汀对高脂血症大鼠血清中TC、TG、LDL和HDL浓度的影响   (略 )与正常对照组比较 *P<0.01；与高脂血症组比较 #P<0.01

    2.3  辛伐他汀对高脂血症鼠主动脉组织和血清NO含量的影响

    本研究表明，辛伐他汀治疗高脂血症大鼠16 W后，治疗组主动脉组织中NO含量高于高脂血症组(P<0.05)，但与对照组相比无显著性差异(P>0.05)；高脂血症组主动脉组织中NO含量低于对照组(P<0.05)；治疗组血清NO含量高于高脂血症组(P<0.05)，但与对照组相比无显著性差异(P>0.05)；高脂血症组血清NO含量低于对照组(P<0.05)，见表3。 表3  辛伐他汀对高脂血症鼠主动脉组织和血清NO含量的影响   (略 )与对照组比较 *P<0.05；与高脂血症组比较 #P<0.05

    2.4  辛伐他汀对高脂血症大鼠主动脉组织中bFGF蛋白含量的影响

    Western-blotting测定结果表明，辛伐他汀高脂血症大鼠16 W后，治疗组主动脉组织中bFGF蛋白含量高于高脂血症组(P<0.05)，而与对照组相比无显著性差异(P>0.05)；高脂血症组主动脉组织中bPGF蛋白含量低于对照组(P<0.05)，见表4和图1。表4  辛伐他汀对高脂血症大鼠主动脉组织中bFGF蛋白含量的影响   (略 )与正常对照组比较 *P＜0.05；与高脂血症组比较 #P＜0.05

    2.5  辛伐他汀对高脂血症大鼠主动脉组织bFGF mRNA表达水平的影响

    RT-PCR检测结果表明，辛伐他汀治疗16 W后，主动脉组织中bFGF mRNA表达水平明显高于高脂血症组(P＜0.01)，而与对照组相比无显著性差异(P>0.05)：高脂血症组主动脉组织中bFGF mRNA表达水平明显低于对照组(P<0.01)，见表5和图2。表5  辛伐他汀对高脂血症大鼠主动脉组织bFGF mRNA表达水平的影响  (略 )与正常对照组比较，*P＜0.01；与高脂血症组比较#P＜0.01

    2.6  辛伐他汀对高脂血症大鼠主动脉环舒张反应的影响

    离体主动脉环实验研究表明，治疗组给予辛伐他汀治疗16 W后，主动脉环对不同浓度Ach的舒张反应百分率均高于高脂血症组(P<0.05)，而与对照组相比无显著性差异(P>0.05)；高脂血症组主动脉环对不同浓度Ach的舒张反应百分率均低于对照组(P<0.05)，见表6。表6  辛伐他汀对高脂血症大鼠主动脉环舒张反应的影响  与正常对照组比较，*P<0.05；与高脂血症组，#P<0.05

    2.7  辛伐他汀对高脂血症大鼠主动脉血管壁形态学的影响

    光镜形态学结果显示，高脂血症组血管内皮细胞排列紊乱、可见血管壁的增殖现象、但未见明显粥样斑块形成，而治疗组血管内皮排列相对平整、有序，接近正常组织结构。

    3  讨论

    内皮功能障碍是高脂血症、动脉粥样硬化、高血压等常见病的始发事件［５］。高脂血症是导致血管内皮功能障碍的重要因素［６］。Alexander［７］研究发现由LDL水平增高所致的内皮功能障碍可以随着LDL的减少而逆转。在高胆固醇喂养的动物中，动脉壁结构未见异常改变时，血管内皮舒张功能就已受到损害。用低密度脂蛋白胆固醇喂养的家兔其颈动脉对Ach的反应迟钝。Orem［８］报道，氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）可导致内皮功能损害，而HDL可逆转LDL对内皮介导的血管舒张反应的抑制作用。据报道三酰甘油水解后释放的自由脂肪酸以及乳糜微粒本身对内皮功能具有损害作用［９］。本实验结果表明高脂血症可导致血管内皮功能障碍和结构变化。这与报道的研究结果一致［１０～12］。

    研究表明，bFGF是一个血管源性的多效能生长因子，在心血管系统中，血管内皮细胞、心肌细胞和平滑肌细胞均有合成bFGF的能力［１３］。近年研究发现，bFGF具有扩张血管、诱导NOS合成的作用，被认为是NO的重要调节因素［１４～16］。本研究表明，高脂血症大鼠血管内皮释放的NO和合成bFGF的能力下降，这可能是导致血管内皮功能障碍的重要因素之一。但关于bFGF改善内皮功能作用的确切机制尚需进一步研究。

    他汀类药物是近十几年开发的三羟基三甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，是目前基本的调脂药物。近来有研究发现他汀类药物除有调脂作用外，且在纠正血管内皮功能障碍，改善血管壁的氧化环境，提高NO介导的内皮依赖性舒张功能中也发挥重要的作用［１７～18］。本研究表明，辛伐他汀能够使高脂血症大鼠血脂降低，血清中bFGF和NO含量及主动脉组织bFGF蛋白含量和bFGF mRNA表达以及主动脉环对不同浓度Ach舒张反应也均增加，接近正常水平。据本实验研究结果和现有的研究资料，提示辛伐他汀可能通过增加内皮NO合成能力，保护血管内皮，改善高脂血症内皮舒张功能。本研究有助于寻找改善和逆转高脂血症导致血管内皮功能障碍药物作用的新靶点提供一定的理论和实验依据。

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