等位基因特异性-PCR联合限制性内切酶消化法检测JAK2V617F突变

              作者：申徐良 陈方平 魏 武 张梅香 史文芝 秦小琪 徐洪亮   

【摘要】  目的：建立敏感特异的JAK2V617F点突变的临床检测方法。方法：基因组DNA从HEL细胞或正常志愿者外周血中提取。采用等位基因特异性-PCR（Allele specific-PCR，AS-PCR）和限制性内切酶消化的方法检测基因组中JAK2V617F突变。结果：本AS-PCR法可对JAK2基因扩增出364 bp的内参照条带，当存在JAK2V617F突变时，又可以扩增出203 bp的突变条带。只有野生型内参照条带364 bp可被BsaXⅠ消化切割。结论：AS－PCR法和限制性内切酶法是检测JAK2V617F突变的敏感特异的检测方法，可以成功应用于临床检测。

【关键词】  等位基因特异性-PCR；JAK2V617F突变；限制性内切酶BsaXⅠ

    Abstract  Objective:To establish a sensitive and specific test for JAK2V617F point mutation. Methods: Genomic DNA was isolated from HEL cells or Peripheral-blood cells from normal volunteer. Allele-specific polymerase chain reactions (AS-PCR) and restriction enzyme digestion were performed to detect the mutation in genomic DNA.Results:A control band(364 bp) can be obtained by AS-PCR,and a muted band(203 bp) can be obtained only when JAK2V617F was presented.Only wildtype control band(364 bp) can be digested by restriction enzyme BsaXⅠ.Conclusion:AS-PCR and restriction enzyme digestion were sensitive and specific tests for JAK2V617F point mutation, and can be successfully used for clinical test.

    Key words  Allele specific-PCR;JAK2V617F mutation;Restriction enzyme BsaXⅠ                

     JAK2基因属JAKs(Janus kinases/Just another kinases )家族成员，是胞浆非受体性酪氨酸激酶, 在多种造血生长因子受体信号转导中发挥关键作用［１］。2005年，Baxter［２］和Kralovucs［３］先后发现大部分骨髓增殖性疾病患者携带有一个获得性的JAK2基因突变-JAK2V617F，该基因突变位于JAK2 基因第1 849位，原来的鸟嘌呤（G）被胸腺嘧啶（T）所取代，导致原位于617 位的缬氨酸错义编码为苯丙氨酸( G→T, JAK2V617F)。该突变的阳

    性率在PV 中高达65%～97%、ET 为23%～57%和IMF 为35%～57%，在AML/CML 中有少量表达［２～6］。JAK2V617F基因突变的发现是近年来骨髓增殖性疾病发病机制的突破性进展，因此有学者将其称为骨髓增殖性疾病的“JAK2时代”。JAK2V617F的发现对于临床上骨髓增殖性疾病的诊断和鉴别诊断有非常重要的意义。为此，我们在临床上建立了两种敏感特异的JAK2V671F点突变的检测方法－等位基因特异性－PCR法（Allele specific-PCR，AS-PCR）和限制性内切酶消化法。这两种方法的应用，有利于提高骨髓增殖性疾病的临床诊断水平。

    1  材料与方法

    1.1  细胞培养

    HEL细胞株购自院上海科学研究院，培养于含10%胎牛血清(Hyclone)、100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素的RPMI1640(Gibco)培养基中，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每3 d换液一次。待细胞生长至>80%汇合时以1∶3的比例传代，取对数生长期的细胞用作实验。

    1.2  基因组DNA制备

    HEL细胞基因组和正常人血液基因组DNA用血液基因组提取试剂盒（上海生物工程公司产品）提取。

    1.3  AS-PCR及产物分析

    PCR引物合成工作由北京奥科生物公司完成。各引物序列如下：公用反向引物(R1)5′-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3′、野生型正向引物(F1)5′-ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG-3′（364 bp）、突变特异性正向引物(F2) 5′-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3′（203 bp）。PCR反应体系为 50 μL,  每管中加入 80 ng DNA模板，公用反向引物(10 μM)1 μL，突变特异性正向引物(10 μM) 1 μL或野生型正向引物(10μM) 1 μL，10X PCR缓冲液5 μL，25 mM MgCl23 μL， 10 mM dNTPs 1 μL，5 U/μL 的Taq聚合酶1 μL，最后用去离子水补足50 μL。置于 MJ Research PTC-100 基因扩增仪中按以下程序扩增: 先94 ℃变性11 min, 然后进行扩增循环，包括变性40 s（94 ℃）、退火1 min （54 ℃）、和延伸1 min（72 ℃），扩增35循环，最后72 ℃延伸10 min。AS-PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶（含EB）电泳鉴定，应用AlphaEaseFC凝胶成像处理系统观察并分析结果。

    1.4.  JAK2V617F的限制性内切酶酶切鉴定

    BsaXⅠ限制性内切酶为NEB公司产品。酶切反应体系：PCR产物20 μL，NEB Buffer 4 4 μL，BsaXⅠ1 μL（2U），去离子水 15 μL，总体积40 μL，37 ℃温育4 h。酶切完毕后于2％琼脂糖凝胶中电泳观察结果。

   2  结果

    2.1.  AS-PCR法检测JAK2V617F突变

    HEL细胞株是人红白血病细胞株，有学者［6］证实HEL细胞为JAK2V617F基因突变的纯合子。因此，在本实验中我们以HEL细胞作为一个已知的含有JAK2V617F突变的的阳性标本，用于建立JAK2V617F突变的检测方法。AS-PCR过程中野生型正向引物(F1)5′-ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAG AAAG-3′和公用反向引物(R1)5′-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3′分别位于基因组上该突变位点的上游和下游，扩增产物为364 bp，该扩增作为AS-PCR的阳性对照，用于检验基因组DNA提取的质量和PCR体系的正确性。无论基因组中是否存在JAK2V617F突变，只要提取的基因组DNA完整，PCR体系正确，这两条引物都可以扩增出364 bp的产物。突变特异性正向引物(F2) 5′-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3′是针对突变位点设计的突变引物，该引物3’端包含2个错配的核苷酸。当基因组中存在JAK2V617F突变时，该引物与公用反向引物(R1)可以扩增出203 bp的产物，当基因组中不存在JAK2V617F突变时PCR不能扩增。图1为AS-PCR的结果，在该图中可以看到野生型正向引物(F1)和公用反向引物(R1)扩增出的条带位于300 bp和400 bp之间（364 bp），同时突变特异性正向引物(F2)与公用反向引物也扩增出一条清晰锐利的条带，大小为200 bp左右（203 bp）。

    2.2  BsaXⅠ酶切分析

    限制性内切酶法所采用的限制性内切酶是BsaXⅠ。BsaXⅠ识别序列为：

    5’-NNNNNNNGGAGNNNNNGTNNNNNNNNNNNN-3’

    3’-NNNNNNNNNNCCTCNNNNNCANNNNNNNNN-5’

    在我们扩增的364 bp的AS-PCR产物中该酶的识别序列为：

    5’-AAATTATGGAGTATGTGTCTGTGGAGACGA-3’

    3’-AAATTTAATACCTCATACACAGACACCTCT-5

    BsaXⅠ可将野生型的364 bp的PCR产物切割为174 bp，160 bp，30 bp三个片断。在2％的琼脂糖凝胶中30 bp的片断分辨不清，174 bp产物和160 bp的产物难以分开而聚集成一条带（图2，lane1）。首先用野生型正向引物(F1)和公用反向引物(R1)对HEL细胞的基因组DNA进行扩增，获得364 bp的扩增产物，然后将该产物用BsaXⅠ切割，电泳结果如图2所示：正常人的对照PCR产物被切割为174 bp和160 bp的两个片断，而HEL细胞的PCR产物不能被切割。

    3  讨论

    可以检测JAK2V617F点突变的方法很多，例如，AS-PCR法,限制性内切酶消化法和直接测序法等，不同的方法有不同的特点和优越性。等位基因特异性PCR最大的优点是敏感性高，只需要极少量的模板DNA便可以得到很好的结果。限制性内切酶方法的检测敏感性不及AS-PCR法，其优点在于简便易行，花费不高，并且可以作为一个高通量筛选的方法。测序法虽然能够提供给我们精确的序列信息，但是由于色谱图背景的影响其敏感性有限。并且该方法耗时耗力，花费比较高，需要一些特殊的仪器设备，在临床检测方面的应用还是有一定的困难［７］。其他检测方法如实时定量PCR法和DNA融解曲线分析法焦磷酸测序法和质谱法等，使用者较少。

    我们以HEL细胞系作为JAK2V617F突变的阳性对照，应用突变特异性引物(F2)(3’端包含2个错配的核苷酸，使得野生型JAK2的难以扩增)对突变基因进行扩增，而后我们又对突变DNA序列进行了限制性内切酶分析，表明这两种方法比较敏感而且特异性强。我们的经验提示：①在一般情况下，80 ng基因组DNA经35个循环扩增后就可以看到明显的条带。若加入模板太多，可能会扩增出一些与目的条带分子量不同的非特异条带，而小于40 ng的基因组DNA则需要增加循环(可能增加假阳性率)才能检测到；②退火温度的选择对于实验的成功是非常重要的，58 ℃是比较适宜的退火温度。若退火温度高于60 ℃时突变特异性引物(F2)将不能扩增出明显的条带，实验失败。当退火温度低于54 ℃时，在正常基因组中也可以扩增出一条模糊条带，即出现假阳性结果。因为不同PCR仪的校正温度不同，所以对于每台PCR仪需要摸条件以找到适宜的工作温度；③限制性内切酶BsaXⅠ由生产商NEB公司提供。生产商推荐该酶的用量最好不要超过2U(消化时间为16 h)。我们的实验证明使用BsaXⅠ 2U，在37 ℃消化1 h就可以得到满意结果。但是我们通常还是将消化时间延长至4 h，以保证实验结果的准确性。

【】
  ［１］ Yamaoka K, Saharinen P, Pesu M,et al.The Janus kinases (Jaks). Genome Biol，2004,5:253.

［２］ Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ,et al.Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in humanmyeloproliferative disorders. Lancet，2005,365:1　054～1　061.

［３］ Kralovics R, Passamonti F, Buser AS,et al.A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders. N Engl J Med，2005，352:1　779～１ ７90.

［４］ James C, Ugo V, Le Couedic JP,et al.A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera. Nature，2005，434:1 144～1 148.

［５］ Levine RL, Wadleigh M, Cools J,et al.Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis. Cancer Cell，2005,7:387～397.

［６］ Zhao R, Xing S, Li Z, et al. Identification of an acquired JAK2 mutation in polycythemia vera. J Biol Chem，2005, 280:22 788～22 792.

［７］ Steensma DP.JAK2 V617F in myeloid disorders: molecular diagnostic techniques and their clinical utility: a paper from the 2005 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology. J Mol Diagn，2006,8(4):397～411.