新Y-STR基因座DYS721在山西汉族人群中的遗传多态性

                   作者：杨思思 张更谦 郭大玮

【摘要】  目的：为了使法医学及人类遗传学研究方面能应用更多Y染色体基因座，本实验从Y染色体基因组候选基因座中筛选出新Y-STR基因 DYS721，调查其在山西汉族人群中的等位基因频率分布情况。方法：根据GDB基因库提供的引物序列进行引物合成，用其对该基因座进行PCR扩增；非变性PAGE电泳分离，银染显带后保存。结果：研究发现山西地区111例汉族男性DYS721共观察到17、18、19、20、21 五个等位基因，其基因多样性为0.6256，在法医学应用方面，其个人识别能力（DP）和非父排除率（PE）均为0.6256。20例女性对照无扩增产物且50组家系调查无突变，同一男性不同组织检测结果分型一致。结论：该基因座有很好的基因多态性和稳定性，是法医学和人类遗传学研究的理想遗传标记。

【关键词】  Y-STR；山西；汉族人群；DYS721

    Abstract  Objective:To make more Y-STRs apply to forensic science and human genetics research,we selected the novel locus(DYS721)from the candidate of Y-STRs loci of human Y chromosome genomic DNA,and investigated the distribution of the new Y-STRs allele frequency in China.Methods:Primers sequences were synthesize according to GDB,and used to amplify the genomic DNA.The PCR products were analyzed by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE) and visualized by silver staining followedby keeping.Results: Five alleles(17,18,19,20,21)had been found in 111 unrelated male venous blood in this research.Genetic diversity(GD)was 0.6256,and if used in forensic science,both the power of discrimination(PD)and the probability of exclusion(PE)were 0.6256.Nothing had been found in 20 female venous blood in Chinese Han population of Shanxi.No mutation was found in 50 father-son pairs. Conclusion:DYS721 have a good level of genetic polymorphism and stability.It could be a perfect inherited marker for forensic science and human genetics research.

    Key words  Y-STR;Shanxi;Chinese Han population;DYS721

    Y染色体微卫星DNA （microsatellites）或称Y-specific Short tandem repeats（Y-STR），是存在于人类Y染色体非重组区（non-recombining region,NRY）的短串联重复序列，它具有男性特有、父系遗传及单倍型遗传等特征，其独特性与STR位点分型检测的优越性相结合成为法医学个体识别和父权鉴定中的新工具。但由于Y染色体遗传标记的多态性远较常染色体基因座低，而且Y-STR基因座在不同人群的差异性远远高于常染色体基因座，因此需要寻找更多的具有多态性Y-STR来满足研究需要［1～4］。本文作者从Y染色体基因组DNA中发现了一个新Y-STR基因DYS721，其与所发现的Y-STR和STRBase中已经报道的Y-STR对比，发现以前未被报道过，基因座的名字（DYS721）由GDB指派，利用GDB（）中的引物序列，建立适当的PCR扩增条件,调查其在山西汉族人群中的频率分布及遗传多态性，并对其在法医学中的应用作初步探讨。

    1  材料与方法

    1.1  血样、DNA的提取

    111例山西汉族无关男性个体和20例女性个体血样，取外周血1 mL，用EDTA抗凝，DNA提取采用酚-氯仿有机溶剂法［５］：TKM1（10 mmol/L Tris-HCL,PH=7.4；10 mmol/L KCl；10 mmol/L MgCl2；2 mmol/L EDTA，pH=8.0）破坏红细胞［４］，2×蛋白酶K消化液（20 mmol/L Tris-HCL,pH=7.6；20 mmol/L EDTA，pH=8.0；300 mmol/L NaCl；1%SDS）和蛋白酶K（100 μg/mL）破坏白细胞；55 ℃水浴3 h～5 h,或37 ℃过夜；酚-氯仿抽提，无水乙醇沉淀，最后溶于去离子水中，-20℃保存备用。

    1.2  引物

    引物序列参照基因库（www.gdb.org），由TaKaRa公司合成，见表1。表1  DYS721基因座信息特征  (略 )

    1.3  目标DNA片段扩增，电泳分离及显色

    25 μL的PCR反应体系包含：50 ng～100 ng基因组DNA，2.5 μL 10×PCR缓冲液（含1.5 mmol/L Mg2+），200 μmol/L dNTP, 1 U Taq DNA聚合酶（柏迈德，北京），引物各0.2 μmol/L。热循环仪采用T1 Thermocycler(Biometra,德国)。热循环参数如下： 94 ℃预变性10 min；95 ℃变性1 min,55 ℃退火50 s,72 ℃延伸50 s,共38个循环；72 ℃保持10 min。非变性聚丙烯酰胺垂直电泳分析PCR扩增产物，胶浓度为8%，交联度为3.3%，恒压220 V，电泳时间20 h。银染显带。

    1.4  等位基因梯阶（allelic ladder）的制备与命名

    筛选出不同等位基因分型的样本进行PCR扩增，然后将其扩增产物混合制成等位基因分型梯阶。各等位基因委托北京奥科公司测序（ABI PRISM 3730 DNA自动测序仪测序），得到重复序列并按国际法医血液遗传学会DNA委员会（ISFG）推荐的原则命名［6,7］。

    1.5  数据分析

    通过直接计数法各等位基因的频率。基因多态性（GD）按照公式 GD=［n(1－∑Pi2)］/(n-1)计算,其中Pi为单倍型频率；其标准误（S.E.）按照公式S.E.=｛［2∑Pi3 －2（∑Pi2）2］/n｝1/2，n为所检验的样本数量，Pi为等位基因频率［８］。根据Y染色体的遗传特点，用和计算GD相同的方法分别计算个人识别能力(power of discrimination,DP)和非父排除率(probability of exclusion,PE)。

    2  结果

    2.1  序列结构及定位

    DYS721测序结果表明存在3个重复区，为(AAGGG)n……(AAGGG)2…… (AAGCA)6。其中……(AAGGG)2…… (AAGCA)6为非重复区，山西汉族人群中没有多态性，而(AAGGG)n为多态性区域，结果显示n的重复次数分别为9，10，11，12，13；按照ISFG推荐的命名标准，将等位基因分别命名为17，18，19，20，21，见表2。表2  DYS721基因座的多态性  (略 )

    2.2  等位基因频率

    在111例山西汉族无关男性个体中DYS721共检测到5个等位基因。该基因座频率分布及群体遗传学参数见表3,且20例女性DNA样品，未见PCR扩增产物。说明其引物有很好特异性。 表3  DYS721基因座的等位基因频率分布和群体遗传学参数  (略 )注：PE为非父排除率；SE为标准误；DP为个人识别能力；GD为基因多态性

    2.3  电泳分析

    用自制的等位基因梯阶进行了非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分型并结合测序结果,表明：DYS721的各等位基因之间的距离为相差5个碱基的重复序列，但分布不等距，经过测序，确为只相差一个重复单位，其分布不等距怀疑是非变性胶所致；在家系调查中三联体和二连体女性均无特异性扩增条带，且50例三联体中父子的等位基因分型一致，没有发现突变（见图1）。

    3  讨论

    在现实生活中各种案件多以男性为主要被鉴定对象，如凶杀、强奸、亲子鉴定等，研究男性特有的Y染色体基因信息，将有更大的法医实际意义，更适合法医实际检案工作。Arnemann等人在1986年发现了Y染色体上的第一个微卫星DNA，重复单位为（GATA）n，命名为DYS19。Y染色体上第一个SNP位点在1994年被Seielstad等人发现。自此，Y染色体上越来越多的各种类型多态性遗传标记被发现。Y染色体单倍型研究成为当前法医DNA研究的一大热点。

    Y-STR作为遗传标记，其只以单倍型的形式从父亲传到儿子。虽然国内外已经报道了许多Y-STR基因座，但新的基因座仍然需要。尤其在法医学应用方面，其分析技术需要用更多的Y-STR对Y染色体单倍型进行精细分型来提高个人识别能力和父权排除率。DYS721位于Y染色体长臂1区1带（Yq11），在该区域内共发现了3个微卫星DNA，均为5核苷酸重复，它们是aaggg和aagca，但在山西汉族人群中aagca重复次数固定，所以此基因座属于简单重复序列。本次实验共检出5个等位基因，片段长度在294 bp～314 bp之间，基因频率在0.0090～0.5495之间，最常见的等位基因为18，其等位基因频率为0.5495; 法医学上的个人识别能力(DP)和非父排除率(PE)均为0.6256。取同一男性个体的心脏、骨骼、肌肉、肾脏、脾脏、肝脏、肺、脑等不同组织提取DNA进行Y-STR的PCR扩增，得到的分型结果完全一致，证明具有较好的组织同一性。该基因座有很好的基因多态性和稳定性，且易于扩增，特异性好，扩增片段在300 bp左右，适合于降解检材。但它的突变率和单倍型频率则需要做进一步的研究。总之，该Y-STR基因座在法医学和人类遗传学研究方面应该具有较高的应用价值，值得推广。

【】
  ［１］ Jobling MA,Tyuler-Smith C.Fathers and sons:the Y chromosome and human evolution［Ｊ］.Trends Genet,1995,11:449～456.

［２］ Sykes B,Irven C.Surnames and the Y chromosome［Ｊ］.Am J Hum Genet,2000,66:1　417～1　419.

［３］ Roewer L,Kayser M.Analysis of molecular variance(AMOVA)of Y-chromosome-specific microsatellites in two closely related human populations［Ｊ］.Hum Mol Genet,1996,5:1　029～1　033.

［４］ 朱运良,朱少建,李建金,等.新Y-STR基因座DYS709在汉族人群中的遗传多态性调查.法医学杂志,2005,20(4):222～223.

［５］ 张更谦,王艳,张艳霞,等.新Y-STRDYS605在山西汉族人群中的多态性分布.遗传HEREDITAS(Beijing),2004,26(3):295～297.

［６］ DNA recommendations.Report concerning further recommendations of the DNA commission of the ISFH regarding PCR-based polymorphisms in STR(short tandem repeat)systems［Ｊ］.Int J Legal Med,1994,107:159～160.

［７］ Gill P,Brenner C,Brinkmann B,et al.DNA Commission of the International Society of Forensic Genetics:recommendations on forensic analysis using Y-chromosome STRs［Ｊ］.Forensic Sci Int,2001,24:5～10.