CTGF反义寡核苷酸对AngⅡ诱导的人近曲肾小管上皮细胞转分化的影响

               作者：陈珑，刘必成，马坤岭，刘宏，罗冬冬

　目的：探讨结缔组织生长因子（CTGF）反义寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的肾小管细胞转分化的可能影响。方法：采用体外培养的人近曲肾小管上皮细胞株（HK2），分别观察CTGF反义寡核苷酸和AngⅡ干预细胞对细胞CTGF mRNA和蛋白质的表达、细胞内超微结构及细胞α平滑肌肌动蛋白（αSMA）表达的影响。结果:AngⅡ干预HK2细胞48h后，细胞CTGF mRNA和蛋白的表达显著增高（P＜0.01）；AngⅡ干预96h后，细胞超微结构显示出间质细胞样结构；这些作用都可被CTGF反义寡核苷酸显著抑制。AngⅡ可以呈时间依赖性地刺激HK2细胞表达αSMA，这些作用可以被CTGF反义寡核苷酸显著抑制（P＜0.01）。对照组错义寡核苷酸无上述作用。结论：CTGF反义寡核苷酸对AngⅡ诱导HK2细胞转分化具有显著的抑制作用，提示CTGF可能介导了AngⅡ诱导的肾小管上皮细胞转分化。

　　［关键词］人近曲肾小管上皮细胞；血管紧张素Ⅱ；结缔组织生长因子；细胞转分化

　　Abstract：Objective  To investigate the effect of connective tissue growth factor antisense oligonucleotide (CTGF AS) on AngⅡ induced tubular cell transdifferentiation . Methods  The influence of CTGF AS on AngⅡinduced HK2 cells CTGF mRNA and protein expression were observed by RTPCR and confocal microscopy respectively.  The effect of CTGF AS on AngⅡinduced cellular ultrastructure were observed by transmissive electronic microscope (TEM).  The expression of αsmooth action (αSMA) were observed by immunocytochemistry.  The control group was treated with scrambled oligonucleotide (SC).Results  It was shown that AngⅡsignficantly induced the increasing expression of CTGF mRNA and protein (P＜0.01, respectively). If the cells were stimulated with AngⅡ for 96h, the cellular ultrastructure showed mesenchymal features.  And these effects could be partially attenuated by CTGF AS.  AngⅡ significantly stimulated the expression of αSMA in a timedependent manner, which could be markedly attenuated by the treatment with CTGF AS (P＜0.01, respectively).  The control group treated with SC had no such effects.Conclusion  AngⅡ induces the EMT of tubular epithelial cells, which can be significantly attenuated by treatment with CTGF AS.  Our data have provided evidence that CTGF might be involved in the AngⅡ induced tubular cell EMT.

　　Key words： human proximal tubular cell;angiotensin Ⅱ; connective tissue growth factor;  cell transdifferentiation  

　　大量研究表明，在各种原因引起的慢性肾脏疾病中，肾小管间质纤维化（tubulointerstitial fibrosis, TIF）是影响肾脏病预后的重要因素。肾小管上皮细胞（tubular epithelial cell, TEC）作为构成肾小管间质结构的主要细胞之一，在激发肾小管间质炎症和纤维化中扮演了十分重要的角色。晚近研究提示，TEC转分化是肾脏硬化早期重要的病理改变。因此了解TEC转分化的发生机制，对于早期防治TIF具有十分重要的意义。

　　众所周知，肾脏局部肾素血管紧张素系统（RAS）的激活在肾脏纤维化发生、中起着关键的作用，已有研究证实血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）可以诱导TEC发生转分化。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）是新近发现的一个重要的致纤维化因子，在以增殖性病变为主的肾脏疾病中表达增高。我们新近的研究也表明，CTGF和糖尿病早期肾脏肥大可能关系密切，AngⅡ受体拮抗剂irbesartan可以抑制该模型肾脏肥大和CTGF的表达［1］；CTGF特异性抗体亦可阻断AngⅡ在体外诱导的肾小管细胞肥大［2］。迄今尚无研究表明CTGF是否介导了AngⅡ诱导的TEC转分化。本研究拟探讨CTGF反义寡核苷酸对AngⅡ诱导的TEC转分化的可能影响，以加强肾脏病早期TEC转分化发生机制的研究，从而为临床早期防治肾脏纤维化的发生提供新的思路。

　　1  材料和方法

　　1.1  细胞株

　　HK2细胞株为人近曲TEC的永生系，其保持了TEC基本的生物学特性，由Prof. Williams（Cardiff, UK）惠赠。细胞用含10%新生牛血清的DMEM培养液培养，每日换液1次，2～3d传代1次。

　　1.2  主要试剂

　　低糖型DMEM培养基（GIBCO公司），新生牛血清 （杭州四季青生物工程材料研究所），AngⅡ (Sigma公司)，CTGF反义寡核苷酸、错义寡核苷酸（全硫代磷酸化，上海捷倍思基因技术有限公司合成）。CTGF反义寡核苷酸（CTGF AS）序列（按［3］选取）：5′TACTGGCGGCGGTCAT3′；错义寡核苷酸(SC)： 5′GGTCTAGCTTGCGGAC3′。TRIPURE RNA提取液（GIBCOL公司）。CTGF的PCR引物（按文献［4］选取），上游引物5′GAGGAAAACATTAAGAAGGGCAAA3′，下游引物5′CGGCACAGGTCTTGATGA3′,选取GAPDH为内参照。山羊抗人CTGF多克隆抗体（R & D公司），FITC标记兔抗山羊IgG（北京中山生物技术有限公司），鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司），超敏SP试剂盒、AEC显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）。

　　1.3  实验分组

　　实验分4组：A组为正常对照组，B组为AngⅡ（10-7mol・L-1）组，C组为AngⅡ（10-7 mol・L-1）加CTGF AS（20μg・ml-1）组，D组为AngⅡ（10-7 mol・L-1）加SC（20μg・ml-1）组。

　　1.4  研究方法

　　1.4.1  RTPCR 

　　用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤各组细胞后，加入TRIPURE RNA提取液，按说明书步骤提取总RNA。用紫外分光光度计测260、280nm吸光值，重复3次，A260nm/A280nm值。按RTPCR操作步骤操作，总反应体系为50μl。反应条件为： 94℃预变性5min； 94℃扩增1min，55℃ 1min，72℃ 1min，35个循环；72℃ 延伸8min。取CTGF和GAPDH的PCR产物各5μl，1.7％的琼脂糖凝胶电泳，用ImageMaster VDS扫描分析仪扫描凝胶图谱。用Total Lab分析软件对PCR条带进行密度扫描分析，目的片段和GAPDH的比值作为实验数据。实验重复3次。

　　1.4.2  激光共聚焦显微镜 

　　细胞行免疫荧光化学染色，一抗为山羊抗人CTGF多克隆抗体,1∶100；荧光二抗为FITC标记兔抗山羊IgG,1∶50。PBS代替一抗作为阴性对照。CTGF染色模式为胞浆着色，共聚焦显微镜下阳性细胞胞浆呈淡绿色或绿色荧光。使用LSM510 Version 2.3软件分析荧光强度。

　　1.4.3  透射电镜分析技术 

　　收集细胞，胰蛋白酶消化，然后以2000r・min-1离心15～20min，弃上清，加入4℃预冷的2％戊二醛，固定2h后经脱水、浸透、包埋、修块、切片及染色等步骤后上镜观察。

　　1.4.4  免疫细胞化学技术 

　　细胞按试剂盒说明用SP免疫细胞化学染色方法测定HK2 细胞α平滑肌肌动蛋白（αSMA）表达。一抗为αSMA， 1∶50。取PBS代替一抗作为阴性对照，用αSMA阳性对照片作为阳性对照。αSMA染色模式为胞浆着色。显微镜下，细胞胞浆呈淡红色或红色者为阳性细胞。按红色染色深浅分为4级：阴性（-）为胞浆内无红色，与背景一致；弱阳性（+）为胞浆内呈淡红色明显突出于背景；阳性（++）为胞浆内呈红色；强阳性（+++）为胞浆内呈深红色。每张盖玻片在400倍高倍镜视野任意计数200个细胞，记录结果，用秩和检验统计各组间差异。

　　1.5  数据处理和统计学分析

　　实验所得数据均以±s表示，多组间资料比较用方差分析，两组间资料比较用t检验，等级资料用秩和检验。使用SPSS 10.0统计软件进行统计分析，P＜0.05为有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  CTGF AS对AngⅡ诱导的HK2 细胞CTGF mRNA表达的影响

　　2.1.1  总RNA纯度的鉴定 

　　A260nm/A280nm值在1.7～2.0之间，说明RNA纯度高。琼脂糖电泳显示28、18S条带清晰，前者荧光强度约为后者的两倍，无其它杂带，说明RNA完整、无降解。

　　2.1.2  RTPCR结果 

　　B组AngⅡ刺激HK2 细胞48h，细胞CTGF mRNA显著增加，与A组比较有显著统计学意义（A、B组OD值分别为 0.144±0.024 与0.598±0.033, P＜0.01）；CTGF AS与AngⅡ诱导后表达明显增加的CTGF mRNA结合后，对CTGF mRNA的逆转录和扩增具有显著的抑制作用（C组OD值为0.379±0.032），与B组比较，P＜0.01；而SC（D组，OD值为0.595±0.031）无此作用（图 1）。

　　2.2  CTGF AS对AngⅡ诱导的HK2细胞 CTGF蛋白表达的影响   

　　B组AngⅡ刺激HK2 细胞48h，细胞CTGF蛋白表达明显增加，与A组比较有显著统计学意义（A、B组ROI值分别为17.41±5.04 与132.45±5.10, P＜0.01）；C组CTGF AS对AngⅡ诱导后细胞CTGF表达的增加具有显著的抑制作用（C组ROI值为82.77±5.09），与B组比较P＜0.01；而SC（D组,ROI值为131.89±5.07）无此作用 (图 2)。

　　2.3  CTGF AS对AngⅡ诱导的HK2 细胞超微结构改变的影响   

　　透射电镜观察显示，A组细胞表面微绒毛及细胞*与A组比较,P＜0.01;**与B组比较,P＜0.01

　　图1  CTGF AS对AngⅡ诱导的HK2细胞CTGF mRNA表达的影响（略）
　　Fig 1  CTGF AS attenuated expression of CTGF mRNAnduced by AngⅡ in HK2 cells

　　内线粒体丰富,粗面内质网稀少；AngⅡ处理48h后与A组比较，细胞表面微绒毛减少，细胞内粗面内质网增多（见图3a箭头所指），线粒体减少，高尔基体增加；AngⅡ处理96h后，细胞超微结构显示出间质细胞样结构，表现为细胞胞膜上有致密样结构出现，胞浆内可见有弥散的细丝样物质（见图3b、c箭头所指）；而CTGF AS干预后，上述现象有所改善；SC无此作用。

　　2.4  CTGF AS对AngⅡ诱导的HK2 细胞αSMA表达的影响

　　2.4.1  AngⅡ对HK2 细胞αSMA表达的时间效应 

　　显微镜下细胞胞浆中有淡红色或红色者为阳性细胞，阴性对照仅见细胞核呈蓝色，胞浆无着色。A组（0h）HK2细胞形态正常，胞浆无着色，胞核呈淡蓝色，即无αSMA表达；AngⅡ干预后，HK2细胞形态逐渐肥大，胞浆染色逐渐增强，即AngⅡ可以呈时间依赖性地促进细胞αSMA表达增加。在72h,αSMA表达阳性的细胞比例显著增加,与A组（0h）比较，P＜0.05；在实验进行96h内细胞的αSMA表达持续增加，并于96h时达峰值 (图4)。

　　图2  CTGF AS对AngⅡ诱导的HK2 CTGF蛋白表达的影响（略）
　　Fig 2  CTGF AS abolished expression of CTGF protein induced by AngⅡ in HK2 cells determined by confocal microscopy

　　图3  AngⅡ对HK2 细胞超微结构的影响（略）
　　Fig 3  AngⅡ induced alterations of cellular ultrastructure in HK2 cells

　　图4  AngⅡ对HK2细胞αSMA表达的时间效应（略）
　　Fig 4  AngⅡ induced the expression of αSMA  in HK2 cells in a timedependent manner

　　2.4.2  CTGF AS对AngⅡ诱导的HK2细胞αSMA 表达的影响 

　　AngⅡ刺激后，HK2细胞形态肥大，胞浆染色增强，αSMA表达阳性的细胞显著增加，与A组比较（秩和检验），P＜0.05；而CTGF AS干预后，胞浆染色有所减弱，αSMA蛋白表达阳性的细胞减少，与B组比较，P＜0.05；SC无此作用(图 5)。

　　图5  CTGF AS对AngⅡ诱导的HK2细胞αSMA 表达的影响（略）
　　Fig 5  CTGF AS attenuated the expression of αSMA by AngⅡ in HK2 cells

　　3  讨论

　　肾小管上皮细胞的表型转化（phenotypic transformation of renal tubular epithelial cells）这一概念是Nielson在1994年首先提出的，即TEC转化为成纤维细胞或肌成纤维细胞(myofibroblast，MyoF)。Strutz 等［5］1995年报道在抗基底膜抗体诱导的肾小球肾炎的小鼠模型中，小鼠TEC可转分化为MyoF。随后Ng等［6］在5/6肾切除模型中发现，受损的TEC可表达MyoF的标志蛋白αSMA，并向间质游动。因此，表型转化的TEC可能是肾间质MyoF的部分来源，直接参与TIF的进展。

　　近年来大量研究揭示，肾脏局部RAS的激活在肾脏疾病进展中起十分关键的作用，AngⅡ可以引起肾脏固有细胞发生肥大、转分化，并合成大量胞外基质成分，促进肾小球硬化和TIF的形成。给大鼠持续静脉输入AngⅡ，可诱导肾小管萎缩、肾间质表达αSMA、胞外基质积聚［7］；使用AngⅡ转换酶抑制剂和其受体拮抗剂能显著抑制输注AngⅡ引起的肾间质胶原和纤维连接蛋白的合成［89］，也可以减轻单侧输尿管梗阻小鼠肾间质αSMA的表达［10］。体外试验证实，AngⅡ可以促进猪肾小管上皮株（LLCPK1）转分化为MyoF，AngⅡ受体拮抗剂可以阻断这一过程［11］。

　　CTGF是一富含半胱氨酸的分泌多肽，相对分子质量36000~38000，由346~349个氨基酸组成，属于CCN家族。1991年，Bradham等首次在人脐静脉内皮细胞条件培养基中发现了CTGF。晚近人们发现CTGF过度表达与某些增生性或纤维化性肾脏疾病的发生密切相关。GoreHyer等［12］研究发现，CTGF可以直接诱导TEC转分化。国内也有研究表明，rhCTGF在体外能刺激人TEC向MyoF转分化，并促进其合成胞外基质［1314］。

　　Ruperez等［15］发现，给正常大鼠注射AngⅡ后3d肾脏CTGF的表达上升，7d时肾小球、肾小管和肾动脉出现CTGF的过度表达，并且其与肾小管损伤程度及纤维结合蛋白沉积密切相关；体外实验中，AngⅡ 能诱导CTGF的表达，CTGF AS能够减少AngⅡ诱导的纤维结合蛋白的合成。提示CTGF可能参与了AngⅡ的致纤维化作用。

　　本研究采用反义寡核苷酸技术，经合理设计的具有高度序列特异性的CTGF AS通过氢键与CTGF mRNA上的杂交位点特异结合，从而阻断CTGF蛋白的表达。我们先前的研究证明，AngⅡ可以呈浓度和时间依赖性地诱导HK2细胞表达CTGF mRNA和蛋白［2］。本研究结果提示，AngⅡ在体外直接诱导HK2细胞CTGF mRNA和蛋白质的表达增加，可以呈时间依赖性地诱导HK2细胞表达αSMA，并且引起细胞超微结构的改变，而上述作用均可以被CTGF AS显著抑制，表明AngⅡ所诱导的TEC转分化可以被CTGF AS所阻断。我们有理由推测CTGF可能介导了AngⅡ所致TEC转分化。

　　众所周知，TIF是慢性肾衰的共同途径和主要机制之一。而TEC转分化与TIF关系极为密切。TEC在TIF形成中既是受害者又是主动参与者。本研究工作结合我们先前的工作进一步表明，TEC过度表达CTGF可能介导了肾脏局部RAS的致纤维化作用，此为研究TIF形成机制开辟了新的思路。

　　［］

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