低频低强度超声波诱导白血病细胞株K562凋亡的研究

                       作者：马燕 ，陈宝安，吴巍，姜藻，钱梦 

　　目的：研究低频低强度超声波诱导白血病细胞株K562凋亡的作用及其机制。方法：取对数生长期的K562细胞，分成实验组和对照组，用MTT法细胞存活率，流式细胞仪判断细胞凋亡，瑞氏染色和透射电镜观察细胞照射后有无出现凋亡，分光光度法检测照射前后K562细胞Caspase3的活性改变。结果：超声照射各组间细胞存活率与对照组相比有统计学差异，但组间无差异；瑞氏染色光镜下可见0.03W组和0.10W组细胞出现细胞核固缩等早期凋亡的改变，0.25W组出现凋亡小体等典型凋亡改变；流式细胞仪检测0.25W组凋亡率为38.87%；照射前后K562细胞Caspase3的活性无差异。结论：低频低强度超声波对白血病细胞株K562有诱导凋亡作用，与照射强度和时间无明显相关。低频低强度超声波诱导K562的凋亡可能不通过Caspase3的途径。

　　［关键词］ 超声；白血病细胞株K562；凋亡

　　Abstract：Objective  To investigate the effect of low frequency and low intensity ultrasound on leukemia cell lines K562 and to clarify the role of Caspase3 in the effect. Methods  K562 cells in log phase were divided into control group and experimental group. The intensity of low frequency(20kHz) and low intensity ultrasound were 0.03, 0.10 and 0.25W・cm-2 respectively.The exposure time were 30 and 60s respectively. K562 cells were incubated in 24well culture plates for different time of periods (6,24,48h) after sonication and the number of vital cells was tested by MTT assay. The morphology of apoptosis was analyzed by Wright’s stain and transmission electron microscopy. The percentage of apoptosis were studied by flow cytometry (FCM). The activation of Caspase3 was tested by Caspase3 kit with spectrophotometric method. Results  The absorbance value of MTT decreased significantly after exposure. The highest apoptosis was found in 0.25W group after 30s sonication and 6h incubation. Morphological alterations observed in cells after exposure to ultrasound included: cell shrinkage, membrane blebbing, chromatin condensation, nuclear fragmentation, and apoptotic body formation. FCM revealed that the percentage of apoptosis of cells in control group, in 0.03 Wgroup, in 0.10W group and in 0.25W group was 7.60%,35.95%,11.57% and 38.87% respectively.There were no significant difference of activation of Caspase3 between control and experimental group(0.25W group after 30s sonication and 6h incubation). Conclusion  Low frequenchy and low intensity ultrasound can induce apoptosis in K562 cell lines after the exposure.The effect is not relevant to the intensity and exposure time of ultrasound.

　　Key words：ultrasound； malignant myeloid cell lines K562；apoptosis   

　　超声是一种机械波，对正常组织损伤小，而其诱导肿瘤细胞凋亡已有许多报道［13］。大部分研究集中于高频超声的杀伤作用［46］，目前高聚焦超声(HIFU)已用于临床［7］。低频超声相对于高频超声对周围组织损伤更小，能够抑制细胞生长和克隆形成，方向性好，并能增强化疗药物的作用，已成为研究热点［810］。本实验用低频超声波对白血病细胞株K562进行照射，研究不同剂量低频超声波对白血病细胞株K562的作用，为低频超声的临床应用提供实验数据。

　　1  材料和方法

　　1．1  材料

　　1．1．1  细胞 

　　K562白血病细胞株,由上海血液研究所提供,第一作者所在实验室常年培养。

　　1．1．2   实验仪器 

　　东南大学江苏铁医美达康医疗器械厂生产的NTY300A型低功率超声肿瘤治疗仪(简称ＮＴＹ治疗仪)，输出功率0.1～5.0Ｗ，可调。

　　1．1．3  主要试剂 

　　MTT购于Sigma公司，annexin Ⅴ购于BD公司，Caspase3试剂盒购于南京凯基生物公司（进口分装），Bcl2/Bax试剂盒购于上海生工生物工程有限公司。

　　1．2  方法

　　1．2．1  细胞培养 

　　K562细胞接种于含10%小牛血清的1640培养液中，置于37℃ 、5%的CO2培养箱中，每2～3d传代1次，试验时取对数生长期细胞。

　　1．2．2  超声照射 

　　将处于对数生长期的K562细胞取出，离心后置24孔培养板中，RPMI 1640培养液重悬，调细胞浓度为5×105ml-1。分成对照组与实验组，实验组选取不同声强（0.03、0.10、0.25W・cm-2）、不同时间(30、60、120s)的超声辐射进行干预。
 
　　1．2．3  MTT法计算细胞存活率 

　　将不同照射组以及对照组的细胞取出，分别计数，培养液稀释至2×105ml-1 ，置于96孔板中，每孔100μl；每组设3个复孔，向每孔加入MTT液10μl（浓度为5μg・ml-1），于37℃ 、5%的CO2培养箱中孵育4h，1500r・min-1平板离心10min；弃上清后加入二亚甲砜（DMSO）100μl・孔-1，振荡10min，待沉淀完全溶解后于550nm处在酶标仪上测吸光度（A）。按下式计算细胞存活率：细胞存活率（%）= A实验孔/A对照孔×100%。

　　1．2．4  流式细胞仪检测 

　　收集不同照射组和对照组K562细胞1×106个，冷PBS洗涤2遍后，用50μｌ1×annexin结合缓冲液悬浮细胞，加annexinⅤ FITC5μｌ，室温避光放置10min,再加PI10μｌ,混匀后室温避光放置5min，冷PBS洗涤1遍，加300μｌ1×annexin结合缓冲液重悬细胞后，立即在流式细胞仪(BectonDickinson)上检测，以annexin+/PI-判断为早期凋亡, annexin+／PI+判断为晚期凋亡。

　　1．2．5   Caspase3的检测 

　　收集细胞，用PBS洗涤细胞2次，2000r・min-1离心5min，收集细胞（3～5）×106ml-1，用50μｌ冰冷的Lysis Buffer悬浮细胞，置冰上20min；4℃10000r・min-1离心3min，把离心上清转移到新的离心管中，并放置冰上；标准曲线法测定蛋白浓度，吸取50μｌ含50～200μg蛋白的细胞裂解上清；再加50μｌ的2×反应液，再加5μｌCaspase3 底物，并避光孵育4h，用酶标仪或分光光度计在λ=405nm或400nm处测定其吸光值；通过计算OD试验组/ OD对照组值确定凋亡组的Caspase3活化程度。

　　1．2．6  瑞氏染色 

　　将干燥好的玻片平置染色架上，滴加染液（Ⅰ液）3～5滴，使其迅速盖满玻片，1min后滴加等量的缓冲液（Ⅱ液），轻轻摇动玻片使染液充分混合，20min后用流水冲去染液，待干，置于显微镜下观察。

　　1．2．7  透射电镜观察 

　　收集不同照射组的细胞，移入10ml玻璃离心管中，加4℃预冷的PBS(0.01mol・L-1，pH7.2)至10ml，用吸管轻轻吹打均匀，2000r・min-1离心20min,弃上清。离心管倾斜一定角度，沿管壁缓慢加入4℃预冷的2%戊二醛，送电镜室。

　　1．3  数据处理

　　采用SPSS12.0统计软件分析。

　　2  结果

　　2．1  MTT法检测结果

　　0.03W照射30s培养6h组和0.1W照射30s培养6h组细胞存活率较对照组明显降低（表1）。同一照射强度不同照射时间不同培养时间组细胞存活率无明显差异，但与对照组相比有统计学差异。

　　表1  低频低强度超声不同照射时间、照射强度组K562细胞的存活率（略）

　　2．2   流式细胞仪检测结果

　　对照组及0.03、0.10、0.25W照射30s孵育6h的各实验组K562细胞凋亡率依次为7.60%、35.95%、11.57%、38.87%，各实验组与对照组比较差异均显著（图1）。

　　2．3  分光光度法检测结果

　　0.25W照射30s培养6h和照射前比较，均OD照射后/OD照射前<1（3次分别为0.992、0.989和0.993），K562细胞Caspase3的活性照射前后无明显改变。

　　2．4  瑞氏染色结果

　　0.03W照射30s培养6h组（图2E）和0.10W照射30s培养6h组（图2F）细胞出现细胞核固缩、染色质边集等早期凋亡的改变；0.25W照射30s培养6h组细胞出现细胞核破碎，可见凋亡小体等典型凋亡改变（图2G、H）。

　　2．5  透射电镜结果

　　0.03W照射30s培养6h组（图3I）和0.10W照射30s培养6h组（图3J）细胞出现细胞核固缩、染色质边集的早期凋亡改变；0.25W照射30s培养6h组细胞出现核碎裂，可见凋亡小体的典型凋亡改变（图3K、L）。A.对照组;B.0.03W照射30s孵育6h;C.0.10W照射30s孵育6h;D.0.25W照射30s孵育6h

　　图1  流式细胞仪检测结果（略）
　　Fig 1  The result of the percentage of apoptosis by flow cytometry (FCM)

　　图2  瑞氏染色结果（100×10，箭头指示凋亡细胞）（略）
　　Fig 2  The morphology of apoptosis by Wright’s stain（100×10）

　　图3  透射电镜图（略）
　　Fig 3  The morphology of apoptosis by transmission electron microscope

　　3  讨论

　　超声的生物学效应包括空化效应、热效应和机械效应三方面［11］。已有报道超声对肿瘤细胞的作用与空化作用有关［12］。Ashush等［13］报道用750kHz超声照射白血病细胞株K562、HL60和U937，结果为超声通过空化效应使细胞膜、DNA、线粒体及其他细胞结构损伤，从而诱导细胞凋亡。本实验用20kHz不同强度的低频超声照射K562细胞株，出现明显凋亡，提示低频超声对K562细胞株有致凋亡作用，国内外尚无相关报道，但低频超声诱导K562凋亡的超声机制有待进一步研究。细胞凋亡的特点是程序性死亡，是机体的一种正常生理现象和保护机制［14］。相反，细胞的快速死亡往往会对机体产生不利影响。因此，肿瘤的倾向于诱导肿瘤细胞凋亡而不是快速致死。各种因素诱导细胞凋亡后，凋亡事件发生呈以下顺序：激活受体，细胞色素c/Apaf1复合体生成，线粒体功能减退，Caspase家族活化，磷脂酰丝氨酸暴露，细胞形态改变，DNA断裂片断出现［15］。根据细胞凋亡事件发生的顺序，本研究观察了不同剂量低频超声辐照后K562细胞中Caspase3活性的改变。Caspase家族属于天冬氨酸蛋白酶，在正常状态下都以无活性的酶原形式表达。当细胞发生凋亡时，一些Caspase活化后依次激活其他Caspase，形成级联反应，促发细胞凋亡。Caspase家族中，以Caspase3、8、9与凋亡的关系最为密切，在细胞凋亡中期执行凋亡的作用。本研究结果显示，低频超声照射前后Caspase3的活性无明显改变，提示低频超声诱导K562凋亡的分子机制不是通过Caspase3的途径，可能通过Caspase家族中其他酶的途径，如Caspase8、Caspase9等，也可能不通过Caspase途径诱导凋亡。细胞凋亡是一个多因素、多通路参与的过程，不能只根据单一指标来判断凋亡，并且，凋亡细胞不同时间出现的凋亡事件不同，而每个指征维持有一个时间段，因此，在今后的研究中，还需要进行多指标同时检测，在不同的时间点进行采样，从而保证检测结果的准确性。

　　本研究在离体细胞中进行，关于低频超声对人体内K562细胞的效应，还有待进一步的研究。

　　［］

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