高糖对人脐静脉内皮细胞GSH.PX活力、NOS及ICAM.1表达的影响

              作者：曾玉，邓红，王筠，苏宁，刘东风

［摘要］目的: 探讨体外培养条件下高糖状态对血管内皮细胞的影响。 方法: 培养人脐静脉内皮细胞株ECV304，分为对照组和高糖组，用分光光度比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶（GSH.PX）活力，RT.PCR法检测细胞间粘附分子1（ICAM.1）mRNA水平，免疫细胞化学法观察内皮细胞型一氧化氮合酶（eNOS）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的蛋白表达。 结果: 高糖组GSH.PX活力明显下降，eNOS、iNOS蛋白表达明显增高，ICAM.1mRNA水平也显著上升。 结论: 在较短时间内糖浓度升高可引起血管内皮细胞GSH.PX活力下降，ICAM.1mRNA、eNOS和iNOS蛋白表达增高，对糖尿病血管病变早期进展起一定的作用。

　　［关键词］ 高糖;人脐静脉内皮细胞;一氧化氮合酶;细胞间粘附分子1
   
　　糖尿病血管并发症是糖尿病患者死亡的主要原因之一，而内皮细胞损伤是血管病变的基础。长期慢性高血糖与血管并发症的关系十分肯定，但是，短暂的、急性高血糖对血管病变的影响研究不多。本研究观察短期高糖刺激对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞株ECV304的生物学特性的影响，为进一步探讨糖尿病血管病变早期进展的机制提供一定的实验依据。

　　1 材料与方法
    
　　1.1 细胞、试剂及仪器
    
　　ECV304购自院上海细胞生物学研究所，DMEM培养液购自Gibco公司，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH.PX）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，Triblue试剂购自上海申能博彩公司，引物由上海申能博彩公司合成，RT.PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，兔抗人内皮细胞型一氧化氮合酶（eNOS）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）多克隆抗体购自Santa Cruz公司，Power VisionTM二步法免疫细胞化学检测试剂购自北京中山生物技术有限公司，数码摄像机及图像分析仪购自日本尼康公司。

　　1.2 方法
    
　　1.2.1 细胞培养及分组  取在含10%小牛血清的低糖DMEM培养液中贴壁生长良好的对数生长期ECV304细胞，以每孔2×10 5 个细胞总数接种到6孔培养板，待细胞生长达50%～60%，用无血清DMEM培养液培养24h，使细胞处于静止状态，此时设为0h，然后加入不同处理因素随机分为2组。（1）对照组（C组）:用低糖DMEM培养液，葡萄糖终浓度为5.5mmol・L -1 ;（2）高糖组（HG组）:用高糖DMEM培养液，葡萄糖终浓度为25mmol・L -1 。分别于12、24、36h收上清液测GSH.PX活力，收细胞测ICAM.1mRNA水平。每组同时设4个复孔。
    
　　1.2.2 细胞上清液GSH.PX活力测定  按试剂盒说明操作，采用二硫对二硝基苯甲酸（DTNB）直接显色法，在412nm处测定吸光度，GSH.PX活力值。

　　1.2.3 细胞总RNA的提取  按照Triblue产品说明提取RNA。甲醛凝胶电泳测定RNA的完整性。提取的RNA用紫外分光光度仪（HITACHI u.2001型）分别检测260、280nm吸光度，并求出A 260 .A 280 ，结果示所提RNA比值在1.8～2.0之间，说明纯度符合要求。
    
　　1.2.4 RT.PCR  引物碱基序列［1］报道。ICAM.1:上游5′.CCGAGCTCAAGTGTCTAAAG.3′，下游5′.TGCCACCAATATGGGAAGGC.3′，扩增片段长度为369bp;β.actin:上游5′.CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT.3′，下游5′.GTTTTCTGCGCAAGTTAGG.3′，扩增片段长度531bp。用AMV逆转录成cDNA，反应条件:42℃60min，95℃10min;合成的cDNA用β.actin引物扩增作为内参照进行ICAM.1的扩增，反应条件:94℃预变性2min;94℃变性0.5min，56℃退火0.5min，72℃延伸1min，共进行35个循环;最后72℃延伸7min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，用FR.200生物电泳图像分析系统（上海复日科技）进行凝胶扫描，运用Smart-view软件分析产物光密度，并以同一标本的β.actin校正作相对量分析。
    
　　1.2.5 细胞eNOS和iNOS蛋白表达的检测和图像分析  按上述条件培养、刺激细胞，但种板前预先在6孔培养板板孔内铺设0.5cm×0.5cm的小玻片3～5块，于24h取出玻片，用预冷丙酮固定10min，晾干后用中性树胶粘于载玻片上，4℃保存备测。免疫细胞化学法测eNOS和iNOS蛋白表达，操作均依照试剂盒说明进行，即:3%H 2 O 2 37℃孵育5min，eNOS和iNOS一抗（1∶50）37℃孵育1h，PBS冲洗3次后加羊抗Ig抗体.HRP多聚体，37℃孵育20min，DAB显色，苏木素复 染，封片。实验同时以PBS代替一抗作空白对照。
   
　　结果判断:阳性为细胞内见棕黄色颗粒。用“Sim-plePCI”图像分析软件分别测定各组培养的ECV304细胞内阳性产物的平均积分光密度值，作统计学处理。

　　1.3 统计学处理
    
　　所有数据用SPSS11.5统计软件进行处理，数据资料以ˉx±s表示，组间比较采用小样本t检验，P<0.05有统计学意义。

　　2 结果
    
　　2.1 细胞上清液中GSH.PX活力
    
　　见表1。结果显示，C组和HG组细胞上清液中GSH.PX活力均随培养时间的延长逐渐上升，但在各时间点，HG组GSH.PX活力显著低于C组（P<0.01）。
    
　　表1  ECV304细胞上清液GSH.PX活力变化（略）

　　Tab1 Activity of GSH-PX in supernatant of ECV304

　　与C组比较，P<0.01
    
　　2.2 内皮细胞ICAM.1mRNA的表达
    
　　见图1A、B。RT.PCR结果显示，ICAM.1扩增片段长度为369bp，β.actin扩增片段长度为531bp，C组ECV304ICAM.1mRNA呈低表达，且不随时间的延长而增加;HG组ICAM.1mRNA表达显著高于同时间点的C组（P<0.01），且随时间延长逐渐增加。
 
　　A.ICAM.1mRNA的RT.PCR电泳图 M.marker;N.阴性;1.0h C组;2.12h C组;3.36h C组;4.12h HG组;5.36h HG组
 
　　B.ICAM.1mRNA与β.actin mRNA的半定量比值
   
　　与C组比较，P<0.01
   
　　图1 ECV304的ICAM.1mRNA表达（略）
   
　　Fig1 Expression of ICAM.1mRNA in ECV304

　　2.3 内皮细胞eNOS、iNOS蛋白表达的变化

    
　　免疫细胞化学染色结果以背景清晰、细胞质着染棕黄色为阳性。eNOS、iNOS蛋白表达均呈现细颗粒状沉积，C组eNOS蛋白呈低表达，iNOS蛋白几乎不表达;HG组eNOS、iNOS蛋白表达均明显增高。见图2、3。图像分析半定量结果为:HG组eNOS、iNOS蛋白表达的平均积分光密度值分别为72.34±12.23和85.89±14.12，与C组（17.33±5.19、10.81±4.56）比较，差异显著（P<0.01）。
 
　　A.C组eNOS低表达
 
　　B.HG组eNOS高表达
    
　　图2 免疫细胞化学染色法检测ECV304eNOS的表达（PV二步法） ×400（略）

　　Fig2 Expression of eNOS in ECV304by immunocytochemistry（PV） ×400（略）
   
　　A.C组iNOS几乎不表达
 
　　B.HG组iNOS高表达
    
　　图3 免疫细胞化学染色法检测ECV304iNOS的表达（PV二步法） ×400（略）

　　Fig3 Expression of iNOS in ECV304by immunocytochemistry（PV） ×400
    
　　3 讨论
    
　　血管内皮细胞参与机体的凝血、免疫、物质转运和生物活性物质释放等重要的生命活动，产生内皮依赖性因子，起调节血管张力、血管生长、血小板功能和凝血功能等作用［2］ 。内皮损伤是导致糖尿病血管病变的重要因素。
   
　　细胞在生理条件下不断产生氧自由基，同时机体存在着清除和抑制自由基产生的系统，一旦平衡被打破，过多的活性氧自由基就可能攻击靶器官造成组织器官损伤以及生物大分子如DNA、RNA、蛋白质和脂肪的结构破坏。丙二醛（MDA）间接反映细胞损伤程度，超氧化物歧化酶（SOD）和GSH.PX活力反映机体清除氧自由基的能力。本实验小组以前的实验［3］ 和本次研究结果显示，短期（36h内）高糖刺激细胞，可导致细胞产生氧化应激，造成自由基增多，抗氧化能力下降，表现为SOD和GSH.PX活力下降、MDA水平上升。
   
　　内皮细胞可释放NO，它是一种自由基性质的气体分子，虽不带电荷，但含有一对未配对的，因而具有活跃的化学性质。NO可引起血管舒张、血流增加和血管通透性增高，这些效应与糖尿病早期的特征性改变相同。NO在糖尿病患者中具有“双刃剑”的作用，合成过多或过少对机体都有损伤作用:NO合成过多对细胞、组织有毒性作用;而NO水平下降不仅使血管舒张异常，而且其抗平滑肌增殖作用、抗血小板凝集作用也减弱，可加速动脉粥样硬化，抗血小板聚集作用降低可促进血管内血栓的形成，并会继发多种病变［4］ 。有报道，NO在糖尿病时的变化是一个随病程改变的过程，即早期NO代偿性合成增加，而晚期合成减少。亦有研究表明，糖尿病微血管并发症早期，过量的NO可能通过细胞毒与细胞抑制作用导致微血管的损伤［5］ 。NO为气体，分子小，半衰期短，仅3～5s，直接测定困难，故研究中多以一氧化氮合酶（NOS）来反映NO产生情况。NOS包括iNOS和构成型NOS（cNOS），cNOS又包括eNOS和神经型NOS（nNOS）。作为血管舒张剂的NO主要是通过eNOS合成的，而iNOS多存在于各种器官的巨噬细胞、平滑肌细胞和枯否细胞中，包括内皮细胞在内的其他类型细胞中则少量存在。本实验结果显示，在正常培养条件下，内皮细胞eNOS呈低表达，iN-OS几乎不表达;而在高糖培养早期，内皮细胞eNOS和iNOS表达显著升高，从而可生成过量的NO，损害内皮细胞。其机制可能为:高血糖致氧自由基产生增多，使Ca 2+ 内流和释放增加，激活cNOS而使NO产生增多;同时氧自由基增多能激活核因子.κB（nuclear factor.κB），由于NF.κB是鼠类巨噬细胞和人iNOS基因转录所必需的，NF.κB的激活可诱导iNOS基因转录过程从而促进它的生物合成［6］ 。由此可见，短期高糖刺激所致的氧化应激引起eNOS、iNOS的激活，并使得NO大量产生造成细胞损伤。
   
　　已有众多实验表明，高表达的粘附分子通过增强血流细胞的粘附，造成相应微血管的阻塞和内皮细胞损伤，从而引起糖尿病血管病变的发生。ICAM.1是分布于细胞表面的一种单链糖蛋白，是免疫球蛋白超家族中的一类细胞粘附分子。ICAM.1主要由血管内皮细胞表达，在正常情况下仅有少量表达，但血管内皮细胞受缺氧、炎性细胞因子、内毒素等刺激后，内皮细胞ICAM.1表达增加，其增高是内皮细胞与白细胞损害与激活的标志［7］。研究结果显示，高糖增加ECV304ICAM.1mRNA的表达，与Altannavch等［8］ 研究结果一 致，进一步提示高糖可能是糖尿病血管病变的一个重要危险因素。其机制一般认为是高糖促进内皮细胞产生氧化应激，而ICAM.1基因启动子上包含NF.κB转录因子结合的位点，其基因表达受一这氧自由基敏感的信号传导系统调控［9］ 。
   
　　本实验结果显示，短时间高糖刺激能使内皮细胞发生氧化应激，GSH.PX下降;同时氧化应激又能引起eNOS、iNOS和ICAM.1表达上调，产生大量NO和粘附分子造成内皮细胞损伤，对糖尿病早期血管病变的产生起一定的作用。

　　［］
     
　　［1］KADO S，WAKATSUKI T，YAMAMOTO M，et al.Expression of intercellular adhesion molecule-1induced by high glucose concen-trations in human aortic endothelial cells［J］.Life Sci，2001，68:727.737.
   
　　［2］MICHIELS C.Endothelial cell functions［J］.J Cell Physiol，2003，196:430.443.
   
　　［3］张彤，邓红，苏宁，等.茶多酚对高糖所致人肾小球系膜细胞活性氧产生的影响［J］.东南大学学报（医学版），2003，22（3）:151.154
   
　　［4］GUZIK T J，KORBUT R，ADAMEK.GUZIK T.Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation ［J］.J Physiol Pharmacol，2003，54（4）:469.487
   
　　［5］BERKOWITZ B A，LUAN H，GUPTA R R，et al.Regulation of the early subnormal retinal oxygenation response in experimental di-abetes by inducible nitric oxide synthase［J］.Diabetes，2004，53:173.178.
   
　　［6］NAKAI K，KUBOTA Y，KOSAKA H.Inhibition of nuclear factor kappa B activation and inducible nitric oxide synthase transcription by prolonged exposure to high glucose in the human keratinocyte cell line HaCaT［J］.Br J Dermatol，2004，150（4）:640.646.
   
　　［7］OKADA S，SHIKATA K，MATSUDAM，et al.Intercellular adhe-sion molecule-1-deficient mice are resistant against renal injury after induction of diabetes［J］.Diabetes，2003，52（10）:2586.2593.
   
　　［8］ALTANNAVCH T S，ROUBALOVA K，KUCERA P，et al.Effect of high glucose concentrations on expression of ELAM.1，VCAM.1and ICAM.1in HUVEC with and without cytokine activation［J］.Physiol Res，2004，53（1）:77.82.
   
　　［9］DIETRICH J B.The adhesion molecule ICAM.1and its regulation in relation with the blood-brain barrier ［J］.J Neuroimmunol，2002，128（1.2）:58.68.