供者淋巴细胞输注治疗小鼠H22肝癌的实验研究

                作者：曾冬香，姜藻，毕延智，张琰

［摘要］目的: 观察供者淋巴细胞输注（DLI）对小鼠H22肝癌的作用。 方法: 荷瘤昆明小鼠分荷瘤对照组（A组）、5.氟脲嘧啶（5.FU）化疗组（B组）、DLI组（C组）及5.FU加DLI组（D组）4组。比较各组小鼠生存期、抑瘤率及瘤体病理检查结果，检测NK细胞及IL.2的活性。 结果: B、C组生存时间长于A组（P<0.01），D组长于C组（P<0.01）;B、C、D各组抑瘤率依次为61.3%、34.7%、89.5%;C、D两组NK细胞及IL.2活性明显高于A、B组（P<0.05）;病理观察见C、D组大量炎性细胞浸润。 结论: DLI对小鼠H22肝癌有治疗作用，是一种潜在可行的实体瘤细胞过继免疫治疗方法。

　　［关键词］ 肝癌;供者淋巴细胞输注;移植物抗肿瘤效应;免疫治疗;小鼠
    
　　随着生物技术的，生物治疗已逐渐成为治疗肿瘤的重要手段之一。目前LAK细胞、TIL细胞、TAK细胞等过继性细胞免疫疗法都是给患者回输其自身的淋巴细胞。本研究通过向荷瘤小鼠体内输注正常的供者淋巴细胞，诱导特有的异体抗肿瘤反应来攻击肿瘤，探索一种新的实体瘤过继免疫治疗方法。

　　1 材料与方法
    
　　1.1 动物
    
　　BALB.C小鼠、KM小鼠，雌性，均为8～10周龄，体重18～22g，由东南大学医学院实验动物中心提供。

　　1.2 试剂
    
　　环磷酰胺（cyclophosphamide，CP）为江苏恒瑞医药股份有限公司产品;5.氟脲嘧啶（5.FU）为天津金耀氨基酸有限公司产品。
    
　　1.3 实体型荷瘤鼠模型建立
    
　　无菌操作取传代8d的H22小鼠腹水，台盼蓝染色，活瘤细胞超过90%，调细胞浓度为1×10 7 ml -1 ，分别取0.2ml接种于KM小鼠右侧腋下皮下，接种后第3天可触及肿瘤结节。

　　1.4 实验分组
    
　　共分4组，每组10只（另备3只中途处死）。A组（荷瘤对照组）:不作任何处理;B组（5.FU化疗组）:接种后第3天开始化疗，5.FU20mg・kg -1 腹腔注射，连续用药7d;C组［供者淋巴细胞输注（donor lymphocyte in-fusion，DLI）组］:接种前11d经脾细胞加CP加供体脾细胞输注的方法［1］ 诱导对BALB.C小鼠的特异性免疫耐受状态，接种后第3、10、17天尾静脉注射供鼠BALB.C脾脏淋巴细胞，细胞数分别为0.5×10 7 、0.5×10 7 及1×10 7 只 -1 。D组（5.FU加DLI组）:接种前4d诱导免疫耐受，接种后第3天开始化疗，方案同B组，第10、17、24天予DLI，细胞数同C组。

　　1.5 观察指标
    
　　1.5.1 生存时间  记录接种当天开始至小鼠死亡的时间，各治疗组生命延长率。
    
　　1.5.2 抑瘤率  待瘤结节长出后每天用游标卡尺测量瘤体长短径，比较瘤体生长情况，计算接种后第15天各治疗组抑瘤率。肿瘤体积=长径×短径 2 .2;抑瘤率=（对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积）.对照组肿瘤体积×100%。
    
　　1.5.3 瘤体光镜下组织病观察  接种后第15天各组处死3只小鼠取瘤体，固定包埋切片，HE染色光镜观察。常规无菌取脾，制备脾细胞悬液以备检测。

　　1.5.4 NK细胞杀伤活性（NKCA）检测  参照［2］的方法略有改动。取上述已制备的脾细胞悬液4×10 6 ml -1 ，加入96孔培养板，每孔100μl，每只小鼠脾细胞设3个重复孔。取传代48h的H22细胞，调细胞浓度为2×10 5 ml -1 ，每孔加入100μl，使每孔效靶比为20∶1。平行设效应细胞对照孔。按MTT方法加人试剂并测OD值，依下式计算杀伤率:
   
　　NKCA（%）=［1-（实验孔OD值-效应细胞对照孔OD值）.靶细胞对照孔OD值］×100%。
    
　　1.5.5 IL.2的诱生及其活性检测  参照文献［3］T淋巴母细胞增殖分析法。（1）IL.2诱生:取上述已制备的脾细胞悬液5×10 6 ml -1 放入培养瓶，置37℃、体积分数为0.05的CO 2 培养箱中培养40h，离心收集上清液，置-20℃冰箱保存备用。（2）制备活化的脾淋巴细胞:无菌取正常KM小鼠脾脏，制成5×10 6 ml -1 细胞悬液，加入ConA使其终浓度为5mg・L -1 ，置37℃、体积分数为0.05的CO 2 培养箱中培养48h，收集细胞，离心洗涤2次，配成5×10 5 ml -1 细胞悬液作为检测IL.2的反应细胞。（3）IL.2活性检测:将待测小鼠脾细胞上清液用MTT比色法测定IL.2活性。

　　1.6 统计学处理
    
　　所有数据采用SPSS统计软件进行分析，结果以ˉx±s或百分率表示，两样本均数比较采用t检验。

　　2 结果
    
　　2.1 小鼠生存情况
    
　　各组小鼠100%死亡。A组生存时间（16.4±2.5）d;B、C组生存时间分别为（23.3±3.2）、（26.3±3.1）d，较A组明显延长（P<0.01）;D组小鼠平均生存期上升到（33.7±5.3）d，生命延长率105.49%，与其他3组相比大大提高（P<0.01）。

　　2.2 小鼠肿瘤生长情况
    
　　接种后第3天即可扪及瘤结节，A组随即迅速增大，C组增大速度稍慢。B、D两组用药后3d内肿瘤逐渐缩小，有些甚至完全消失;B组停药后3d左右肿瘤又逐渐增大;D组肿瘤复发时间延长至7d左右，再次DLI可控制瘤体生长。接种后15d各组小鼠肿瘤生长情况见表1。
    
　　表1  接种后15d各组小鼠肿瘤生长情况（略）
    
　　1）与A组比较，P<0.01;2）与B组比较，P<0.01;3）与C组比较，P<0.01
    
　　2.3 对H22肝癌小鼠NK细胞活性的影响

    
　　A、B、C、D各组NK细胞活性依次为16.9±2.8、35.9±3.1、78.4±5.5和47.3±3.7，正常小鼠为66.2±4.9。A组NK细胞活性较正常小鼠明显下降（P<0.05），B组与A组比较差异无显著性（P>0.05），C组NK细胞活性达正常水平（与A组比较， P<0.05），D组与其余各组比较均有显著差异（均为P<0.05）。
    
　　2.4 IL.2的产生及其活性
    
　　A、B、C、D各组IL.2活性依次为0.258±0.260、0.218±0.016、0.325±0.044和0.393±0.028，正常小鼠为0.378±0.064。A组IL.2活性明显低于正常小鼠（P<0.05），B组与A组比较差异无显著性（P>0.05），C、D两组IL.2活性达正常水平（与A组比较，均为P<0.05）。
    
　　2.5 光镜下瘤体组织病变化
    
　　光镜下各组肿瘤组织均有不同程度的出血、坏死，其中B组纤维化明显，C、D两组瘤组织大片坏死，瘤细胞变小，核固缩、变性，间质内有大量炎性细胞浸润（图1），以淋巴细胞及巨噬细胞多见，D组还可见大量增生的淋巴滤泡（图2）。
 
　　图1 C组瘤体光镜下组织病理学改变 ×100　箭头示间质内大量炎性细胞浸润（略）
   
　　图2 D组瘤体光镜下组织病理学改变 ×100 箭头示增生的淋巴滤泡（略）

　　3 讨论
    
　　早在20世纪70年代就有报道，用胸导管分出来的供者淋巴细胞不经任何预处理输入来恶性肿瘤并取得暂时性的疗效［4］ 。近年来，非清髓异基因移植治疗乳腺癌和肾细胞癌的研究表明，移植物具有移植物抗肿瘤效应（graft-versus-tumor effect，GVT）［5～7］ ，给黑色素瘤患者输入体外扩增的自体肿瘤敏感淋巴细胞可产生抗肿瘤作用［8］ 。以上结果均为实体瘤的细胞免疫治疗提供了可能。
   
　　本实验吕艳等脾细胞加CP加供者脾细胞输注的方法［1］ 诱导出KM小鼠对BALB.C小鼠的特异性免疫耐受状态，省去了免疫抑制剂的使用，改良了传统的移植前大剂量放、化疗的预处理方案，为DLI创造了条件;继而采用徐开林等［9］ 探索出的分次、逐渐增量输注的方法，于诱导耐受后第14、21、28d加用供者淋巴细胞，逐步增加GVT作用的同时避免了严重的移植物抗宿主病的发生，使小鼠生存时间明显延长，瘤体生长缓慢，复发延迟，瘤组织病理学检查示瘤细胞大片坏死，间质大量炎性细胞浸润、淋巴滤泡增生，证明输入的供者淋巴细胞在体内能发挥抗肿瘤作用。而且，5.FU化疗与DLI联合应用比两者单独应用能更显著地抑制小鼠肝癌皮下转移瘤的生长，表明DLI与化疗有协同作用。Bishop等不久前曾报道了供者淋巴细胞可以在小鼠转移性乳腺癌模型中诱导出GVT效应，使瘤体缩小，在此基础上，临床用白细胞抗原相配的供者淋巴细胞治疗转移性乳腺癌亦可使瘤体消退［10］ ，本实验结果与此有相似之处，可见该方法有用于临床的可能性。
   
　　加输供者淋巴细胞确切的治疗机制尚不完全清楚，但多数学者认为是通过GVT来诱导疾病缓解，多种效应细胞、细胞因子介导的免疫反应在GVT中抑制了恶性细胞克隆的增殖。涉及的效应细胞主要有T细胞、NK细胞等;细胞因子的作用也不容忽视，比较重要的有白细胞介素2（IL.2）及干扰素（IFN）［11］ 。本实验同步观察了荷瘤小鼠NK细胞活性及IL.2产生能力，结果小鼠荷瘤后两者均明显下降，DLI后两者明显升高达到正常水平，表明DLI可显著增强NK细胞活性，提高IL.2的产生能力。但5.FU化疗与DLI联用后NK细胞活性反不及单纯DLI，据此推测化疗对免疫治疗可能有抑制作用，也可能与实验设计时化疗与免疫治疗时间间隔太短有关，故还有待进一步摸索。5.FU化疗与DLI联用可使IL.2的产生较单纯DLI偏高，表明 对于体液免疫，DLI与化疗有协同作用，而IL.2又能诱导原始NK细胞的增殖和分化，促进前体NK细胞的分化成熟，增强NK细胞裂解肿瘤细胞的能力。
   
　　以上结果提示，用供者淋巴细胞来攻击肿瘤细胞，较传统化疗更安全有效，且与化疗具有协同作用，可为实体瘤的过继免疫治疗提供新途径。

　　［参考］
     
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　　［3］孙丰润，邱世翠，张循格，等.小叶女贞对小鼠淋巴细胞增殖和IL.2产生的影响［J］.滨州医学院学报，2003，26（1）:1.2.

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