维甲酸纳米粒滴眼液抑制后发性白内障的实验研究

              作者：王梓，栾洁，李长生，陆杨艳，夏强，顾宁

　［摘要］目的: 研究维甲酸（RA）纳米粒滴眼液对兔后发性白内障形成的影响及对兔眼的毒性作用。 方法: 18只新西兰白兔被随机分为A、B、C3组，进行晶状体囊外摘除术。A组为空白对照组，B组术后滴300μg・ml -1 的RA纳米粒滴眼液，C组术后滴700μg・ml -1 的RA纳米粒滴眼液。术后观察12周，行后囊膜混浊（PCO）评分及照相，比较各组晶状体PCO情况;光镜观察晶状体上皮细胞增殖情况并观察药物的毒性作用。 结果: 术后12周A、B、C组发生PCO的眼数分别为10、6、4眼。B组和C组PCO发生率低于A组，差异有显著性（均为P<0.05），两用药组之间PCO发生率无显著差异（P>0.05）。组织病检查显示，A组的晶状体上皮细胞增殖较B组和C组明显，各组虹膜及睫状体均未出现慢性炎症反应。 结论: RA纳米粒滴眼液能有效抑制晶状体上皮细胞的增殖，预防兔后发性白内障的形成，无明显毒性，并且使用方便，具有临床应用价值。

　　［关键词］ 维甲酸;纳米粒;晶状体上皮细胞;后发性白内障;兔
    
　　随着显微手术技术及设备的不断完善，白内障囊外摘除（extracapsular cataract extraction，ECCE）或超声乳化（phacoemulsification）联合后房型人工晶状体植入术已成为白内障的主要复明手术，严重手术并发症明显减少，后发性白内障［又称后囊膜混浊（posterior cap-sular opacification，PCO）］已成为影响术后视功能的主要并发症。本研究在对新西兰大白兔行晶状体摘除术后应用维甲酸（retinoic acid，RA）纳米粒滴眼液滴眼，观察晶状体后囊膜等眼部组织的变化，了解RA纳米粒滴眼液对后发性白内障的预防效果。

　　1 材料与方法
    
　　1.1 RA纳米粒滴眼液
    
　　RA纳米粒滴眼液由东南大学生物医学工程系研究室研制，粒径12nm，微孔滤器过滤后备用。

　　1.2 动物与分组
    
　　成年健康的清洁级新西兰大白兔18只，体重2.0～2.5kg，月龄2～4个月，雌雄不限，眼部检查无异常，随机分为A、B、C3组，每组6只（12眼）:A组为空白对照组，B组为300μg・ml -1 RA纳米粒滴眼液组，C组为700μg・ml -1 RA纳米粒滴眼液组。

　　1.3 术前准备
    
　　手术前2d用0.25%氯霉素眼液滴眼，每日3次。
    
　　术前30min使用复方托品酰胺眼液点眼，每5min1次，共5次。2%戊巴比妥30mg・kg -1 静脉麻醉，0.5%碘伏常规消毒术眼。

　　1.4 手术步骤
    
　　开睑器开睑，0.5%碘伏冲洗结膜囊，用3.2mm穿刺刀做透明角膜切口，前房内注入黏弹剂，截囊针开罐式截囊，直径约5mm。扩大角膜切口至5mm，水核分离，然后圈套器娩出晶体核，双腔针吸出残余皮质及黏弹剂，切口层间注水至水密状态。术毕结膜下注射庆大霉素2万U加地塞米松2.5mg。

　　1.5 术后处理
    
　　（1）术眼每天滴0.25%氯霉素眼液加0.5%醋酸可的松眼液4次，共4周。组每天分别滴300μg・ml -1 RA纳米粒滴眼液3次和700μg・ml -1 维甲酸纳米粒滴眼液3次，共12周。
   
　　（2）术后第1、2、3、7、14天和4、6、12周于裂隙灯显微镜下检查术眼伤口、结膜、角膜、虹膜和前房的情况。房水混浊分级:0级，房水清晰透明，Tyndall现象（-）;1级，房水Tyndall现象（+），较少或无纤维素性渗出，窄裂隙1个视野内可见1～10个光点;2级，房水Tyn-dall现象（++），明显纤维素性渗出，窄裂隙1个视野内可见11～30个光点;3级，房水明显混浊伴大量纤维素性渗出或前房积脓。

　　（3）术后第2、4、8、12周在裂隙灯显微镜和直接眼底镜下检查PCO情况。按Odrich后发性白内障评分法［1］ 对后发性白内障进行分级，并且对后囊膜进行照相。
   
　　（4）术后12周处死动物，摘取眼球，沿睫状体扁部全层环形剪开，取完整的眼前段组织（包括角膜、虹膜、睫状体、后囊膜）及视网膜组织，10%的甲醛固定24h，常规脱水、浸蜡、石蜡包埋及切片，常规HE染色，普通光镜检查。
    
　　1.6 统计学处理
    
　　采用SPSS10.0统计软件包进行统计处理。

　　2 结果
    
　　由于手术过程中B组中有1眼后囊膜破裂，饲养过程中A组和C组均有1只兔子死亡，均排除在实验之外。最后A组有10眼，B组有11眼，C组有10眼。

　　2.1 术后结膜反应情况
    
　　术后前3d，所有术眼均有不同程度的结膜充血，1周左右充血逐渐消退。术后第1、7天各组结膜充血程度差异无显著性（P>0.05）。
　
　　2.2 术后角膜反应情况
    
　　术后1周内所有眼的切口周围角膜水肿相对较重，绝大多数兔眼的术后反应是角膜轻度或中度水肿，但都在1周左右自行消失。术后第1、7天，各组角膜水肿程度差异无显著性（P>0.05）。所有术眼均无角膜上皮缺损、角膜炎等情况发生。

     
　　2.3 术后前房内反应情况
   
　　术后第1天绝大多数兔眼的房水混浊程度为2级，术后第4天起房水混浊程度逐渐减轻，第7天各组房水混浊程度差异无显著性（P>0.05），见表1。
    
　　表1  术后第3天各组前房房水闪辉及房水细胞的分级（略）

　　Tab1 Grading of anterior chamber flare and aqueous humor cells at3days after operation
    
　　2.4 术后不同时期PCO情况
    
　　术后4周，各组PCO发生率差异无显著性（P>0.05）。术后第8、12周，对照组后囊膜明显混浊，用药组后囊膜不混浊或轻度混浊（见图1）。用药组（B组）PCO发生率低于对照组，差异有显著性（P<0.05），用药两组间差异无显著性（P>0.05）。见表2。

　　图1 术后12周A组（左）和B组（右）的后囊膜照片（略）
   
　　Fig1 At12weeks postoperatively，the biomicroscopic photographs of posterior capsular opacification in control eye（the left one）and in retinoic acid treated eye（the right one）

　　表2  术后12周各组晶状体PCO评分情况（略）

　　注:B vs A，P<0.05;C vs A，P<0.05;B vs C，P>0.05
　　
　　2.5 组织病观察结果
    
　　A组晶状体后囊膜中央部有多层增生移行的晶状体上皮细胞、大量排列紊乱的成纤维细胞和胶原纤维。B组和C组后囊膜赤道部有少量残留的晶状体上皮细胞及皮质，但中央后囊膜的表面无明显晶状体上皮细胞。各组虹膜及睫状体均未出现慢性炎症反应。见图2。

　　图2 A组（左）和B组（右）后囊膜光镜照片 ×400（略）
   
　　Fig2 Photomicrographs showing posterior capsule of group A（the left one）and group B（the right one） ×400
　　
　　3 讨论
    
　　PCO，是目前白内障手术后视力下降的主要原因之一，由残留的晶状体上皮细胞（LEC）增生、移行、化生为成纤维细胞而引起。此外，虹膜及睫状体上皮细胞、炎症细胞亦可通过细胞化生以及纤维蛋白的渗出参与PCO的发生［2］ 。后发性白内障一旦形成，其目前多采用YAG激光后囊切开术，除需要较昂贵的激光设备外，还存在一些并发症，如黄斑囊样病变、视网膜脱离、青光眼等，且激光有可能损伤人工晶体，因此，后发性白内障严重影响白内障手术复明的效果，其预防显得尤为重要。
   
　　RA又称维A酸、维生素A酸、维生素甲酸、视黄酸，它是感光细胞的中间代谢产物，也是维生素A在体内的衍生物。现在认为，RA可以与细胞质的RA蛋白（CRABP）结合形成复合物，再与核上的RA受体（RARs）结合，通过激活核受体使其构象发生改变，使其具有与基因调控区域上的特定DNA序列特异性结合的能力，从而调控基因表达，在细胞的生长、分化、细胞生理凋亡等方面起重要作用［3］ 。RA可以抑制视网膜色素上皮细胞、人类晶状体上皮细胞和成纤维细胞的增殖［4］ 。在眼科，RA主要用于增殖性病变，如增殖性玻璃体视网膜病变、干燥性角膜病、结膜角膜瘢痕性疾病等的治疗。
   
　　本实验结果表明，术后12周对照组晶状体后囊膜中央部有多层晶状体上皮细胞增殖和大量成纤维细胞，而且还混有淋巴细胞等，而RA用药组晶状体后囊膜较透明，光镜检查晶状体中央后囊膜无明显晶状体上皮细胞增殖和炎症细胞附着，眼内组织无明显病理改变。按Odrich后发性白内障评分法［1］ 进行观察，用药组的PCO程度低于对照组，300μg・ml -1 和700μg・ml -1 两种药物浓度组的PCO程度差异无显著性。作者对RA纳米粒滴眼液生物学效应的研究（文章待发）发现，300μg・ml -1 和700μg・ml -1 RA纳米粒滴眼液滴眼后3h在房水中达到最高药物浓度，分别为（1.017130±0.001667）μg・ml -1 和（1.038313±0.002624）μg・ml -1 ，均达到了以往体外实验［4］ 证实的RA抑制细胞增殖的10 -8 ～10 -5 mol・L -1 （3×10 -3 ～3mg・L -1 ）的有效浓度范围，但RA纳米粒滴眼液的最低有效药物浓度仍需要进一步研究。后发性白内障病变程度和组织病理学两方面的结果都说明，RA对后发性白内障的发生有抑制作用。
   
　　关于药物副作用，术后大部分兔眼都有轻度角膜水肿混浊现象发生，所有角膜水肿混浊在术后7d均恢复透明，用药组和对照组之间没有显著性差异，说明RA对角膜无明显损害。本研究还显示，所有兔眼术后前房炎症反应情况都较轻微，3组之间无显著差别，并且组织病理学检查虹膜、睫状体均未见慢性炎症反应，说明RA对眼组织无致炎作用，对房水循环无明显影响。
   
　　目前已经有将含有RA的灌注液用于白内障手术之中的临床研究以及术中植入RA修饰的人工晶体的实验研究，均发现RA可以抑制后发性白内障的形成，且对眼组织没有明显的毒副作用［5］ 。但是上述研究中RA只能单次应用，术后一段时间RA将完全代谢消失，不能起到长时间抑制后发性白内障形成的作用。本研究所用的RA纳米粒滴眼液可以方便地长期使用，使房水中药物能够一直维持在有效浓度范围内，从而起到预防后发性白内障形成的作用，非常具有临床应用价值。 

　　［］
     
　　［1］ODRICH MG，HALL S J，WORGUL B V，et al.Posterior capsu-lar opacification:experimental analysis［J］.Ophthalmic Res，1985，17（2）:75.79.
   
　　［2］MURRAY T G，STERN W H，CHIN D H，et al.Collagon shield heparin delivery for prevention of postoperative fibrin［J］.Arch Ophihalmol，1990，108（1）:104.106.
   
　　［3］ROBERTS A B，SPOM M B.Cellular biology and biochemistry of the retinoids［A］.SPORNM B.The Retinoids［M］.Orlando:Ac-ademic Press Inc，1984.210.213.
   
　　［4］CAMPOCHIARO P A，HADSETT S F，CONWAY B P.Retinoic acid promotes density dependent growth arrest in human retinal pig-ment epithelia cells［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1991，32（1）:65.69.
   
　　［5］夏小平，王宁，易小灵，等.维甲酸抑制后发性白内障形成的临床研究［J］.实用眼科杂志，2004，22（3）:177.179.