CTGF在低氧性肺血管重建中的作用

【关键词】  肺血管重建

    Expression of integrinα5 in endometriotic cells and its steroidal regulation
    
　　Abstract:Objective To study the expression of integrinα5 in cultured human endometriotic cells and its regulation by steroidal hormones.Methods Eighteen samples of ectopic endometrium were cultured in vitro.The cultured endometriotic cells were divided into five groups:control group，E2 group，P group，TAM group and RU486group.The expression of integrinα5 mRNA of each group were determined by reverse transcript polymerase chain reaction method.Results The expression of integrinα5 mRNA in E2 and P group was1.415±0.286and1.304±0.170respectively，which were significantly higher than that of control group（1.082±0.069，P<0.05）.In TAM and RU486group，it was0.882±0.013and0.866±0.054re-spectively，which was significantly lower than that of control group（P<0.05）.Conclusions Estradiol and progesterone may regulate the expression of integrinα5 .Estradiol and progesterone increase the integrinα5 mRNA in ectopic endometrium，and promote the adhesion leading to endometriosis.Tamoxifen and mifepriston decelerate occurrence of endometriosis by way of resisting estradiol and progesterone or inhibiting ectopic endometrial cells from secreting integrinα5 .
   
　　Key words:endometriotic cells;cell culture;integrinα5 ;reverse transcription-polymerase chain reaction;steroidal hor-mones 

    ［摘要］目的: 通过建立低氧性肺动脉高压大鼠模型，探讨结缔组织生长因子（CTGF）在大鼠低氧性肺血管重建中的作用。 方法: 通过间断常压低氧法建立大鼠低氧性肺动脉高压模型，用右心导管法测定平均肺动脉压（mPAP）;称重右心室肥厚指数［RV.（LV+S）］;肺组织切片经HE染色后图像分析技术定量检测大鼠肺小动脉的形态改变;免疫组织化学染色法测定肺小动脉管壁CTGF蛋白表达，并经图像分析半定量检测其表达强度。 结果: 3周后，低氧组大鼠的mPAP、RV.（LV+S）、反映管壁增厚的管壁厚度占血管外径的百分比和管壁面积占血管总面积的百分比两指标均高于正常对照组（P<0.01）。正常对照组大鼠肺小动脉壁CTGF蛋白未表达;低氧组大鼠肺小动脉壁外膜CTGF明显表达，内膜略有表达，中膜几乎无表达。 结论: 常压低氧3周可成功建立肺动脉高压大鼠模型，CTGF与低氧性肺血管重建密切相关。

　　［关键词］ 低氧;肺血管重建;结缔组织生长因子
    
　　长期低氧会导致肺动脉高压和肺源性心脏病，低氧性肺动脉高压的形成及主要与低氧性肺血管收缩及肺血管重建有关。已经明确，长期低氧可使肺循环血管内皮细胞、平滑肌细胞、外膜成纤维细胞增殖肥大，同时这些细胞产生和分泌的细胞外基质增多、异常沉积，导致低氧性肺血管重建，使肺动脉压力持续增高，形成慢性肺心病［1］ 。多种生长因子对低氧性肺血管重建的形成及维持起着十分重要的作用。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）隶属CCN家族，能刺激血管平滑肌细胞、人肺成纤维细胞等增生，促进细胞外基质成分的产生，且与众多和低氧性肺血管重建相关的生长因子，如血管内皮生长因子、转化生长因子.β等关系密切，但CTGF在低氧性肺血管重建中的作用目前尚不清楚。本研究通过建立大鼠肺动脉高压模型，观察慢性缺氧性肺动脉高压大鼠肺小动脉结构的变化及肺血管CTGF表达水平，旨在探讨CTGF在缺氧性肺动脉高压发病中的可能作用。

　　1 对象与方法
    
　　1.1 动物
    
　　20只健康SD雄性大鼠，由东南大学医学院动物实验中心提供，平均体重（254.0±3.9）g，日龄70d左右;普通大鼠饲料（动物中心提供）喂养，饮用自来水，
    自由摄食和饮水，分为低氧组和正常对照组。
     
　　1.2 主要仪器
    
　　常压低氧舱（自制），主体由厚15mm的有机玻璃建成，容积约280L（96cm×65cm×45cm），配有测氧仪、电磁阀、减压阀、电动风扇;MacLab.4s AD Instru-ments生物信号采集系统（Australia AD Instruments公司生产）;SP.2000病理图文报告系统2.0版（上海世珈医疗设备有限公司生产）。

　　1.3 主要试剂
    
　　胃蛋白酶消化液（北京中山生物技术有限公司生产）;浓缩型DAB试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司生产）;CTGF（L.20）（Santa Cruz公司生产）;Vltra-Sensitive S.P超敏试剂盒（Kit.9706，福州迈新生物技术开发有限公司生产）。

　　1.4 试验方法
    
　　1.4.1 建立肺动脉高压大鼠模型 

　　采用薛全福法［2］ ，将试验组10只大鼠置于（10.0±0.5）%氧浓度的常压低氧舱内，间断低氧，每次舱内氧浓度从21%降至10%的时间约为30min，每天8h，每周6d，第7天不低氧，共3周;正常对照组10只大鼠置于同一实验室内，呼吸室内空气。
    
　　1.4.2 肺动脉压的测定 

　　所有试验用大鼠以2%戊巴比妥40mg・kg-1 行腹腔内注射麻醉后，将充盈肝素生理盐水的硅胶导管插入右颈外静脉，缓慢推入右心室，导管另一端连接静脉压力换能器到MacLab.4s AD Instruments生物信号采集系统，观察至屏幕显示典型的肺动脉压波形，用Chart v3.5.2生物信号分析系统记录并计算平均肺动脉压（mPAP）。
    
　　1.4.3 右心室肥厚指标检测 

　　肺动脉压检测完毕后放血处死大鼠，完整取出心脏和肺组织，心脏置10%中性甲醛溶液中固定1周，剪去心房组织，分离右心室（RV）和左心室加室间隔（LV+S），滤纸吸干后分别称重，计算RV.（LV+S）值以反映右心室肥厚的程度。
    
　　1.4.4 肺组织标本采集及标本切片制作 

　　将左肺置10%中性甲醛溶液中固定，标本严格于垂直位石蜡包埋，垂直于支气管细支气管断面，沿矢状面最大周径处进行横断取材约3mm厚，酒精梯度脱水，二甲苯透明标本，浸蜡，包埋，连续切片（厚度5μm），作HE染色。

　　1.4.5 肺组织切片的半定量分析 

　　显微镜下观察大鼠肺组织切片，用SP.2000病理图文报告系统进行图像采集，IMAGE.PRO plus4.5软件进行图像分析，测量与呼吸性细支气管及肺泡管伴行的肺小动脉外径、管壁厚度、血管总面积及管壁面积，管壁厚度占血管外径的百分比（WT%）和管壁面积占血管总面积的百分比（WA%）。每只大鼠肺切片共测量10条血管的上述指标，计算均数进行统计分析。
    
　　1.4.6 免疫组织化学分析 

　　将上述肺组织标本切片贴于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，常规脱蜡至水，3%H2 O2 孵育，胃蛋白酶消化液修复抗原，正常兔血清封闭，滴加一抗（山羊抗大鼠，Santa Cruz公司）和二抗（兔抗山羊，福州迈新生物技术开发有限公司），DAB显色，苏木素轻度复染后显微镜观察（以细胞质清晰棕色为阳性），并进行免疫组织化学图像分析。
    
　　1.4.7 统计学处理 

　　采用SPSS11.5统计软件，数据以ˉx±s表示，组间均数比较采用两样本均数配对t检验。
    
　　2 结  果
    
　　2.1 肺动脉高压模型建立
    
　　常压低氧3周后，低氧组的大鼠肺小血管普遍增厚，管腔狭窄，mPAP为（26.73±1.52）mmHg（1mmHg=0.133kPa），高于正常对照组的（15.50±0.82）mmHg，差异有显著性（P<0.01），提示低氧性肺动脉高压模型制作成功。
    
　　2.2 右心室肥厚形成
    
　常压低氧3周后，低氧组的大鼠RV.（LV+S）为（33.36±1.46）%，高于正常对照组的（22.67±0.76）%，差异有显著性（P<0.01），提示低氧3周后产生了右心室肥厚。
   
　　2.3 低氧性肺血管重建模型形成
    
　　经过肺小血管图像分析，常压低氧3周后，低氧组大鼠的WT%、WA%分别为63.74±2.54和78.47±2.73，均高于正常对照组（分别为33.45±5.23和40.56±3.45），差异有显著性（P<0.01），提示低氧3周后低氧性肺血管重建形成。

　　2.4 CTGF在血管壁的表达
    
　　正常对照组肺小动脉壁未检测到CTGF表达（图1）;而低氧组肺小动脉壁CTGF表达呈阳性，且以管壁外膜居多，内皮层略有表达，中膜平滑肌层几乎无表达（图2）。免疫组织化学图像分析结果提示，肺组织切片CTGF阳性面积占肺小动脉面积比正常对照组为0，而低氧组为2.23±0.30。
 
　　3 讨  论
    
　　肺血管重建是肺动脉高压持续的关键因素，其病理改变主要为内皮细胞肿胀和肥大、中层平滑肌增生肥厚、胶原纤维和弹力纤维等细胞外基质成分增多。本研究发现，在常压低氧3周后，大鼠mPAP明显升高，右心室肥厚;图像分析提示代表肺血管重建的两个指标WT%和WA%均较正常对照组明显增高，说明已成功建立了低氧性肺血管重建模型。

    CTGF是一种富含半胱氨酸的多肽，属即刻早期基因家族CCN的成员之一。CTGF对血管的内皮细胞、平滑肌细胞、作为支撑结构的细胞外基质等组织均有重要的生物学作用，且对低氧等原因引起的血管生成过程有积极的促进作用［3］ ;机械应力（如血管压力增高）［4］ 、低氧［5］ 及与肺血管重建密切相关的血管内皮生长因子［6］ 等生长因子均可诱导CTGF表达增加。  

　　实验中作者观察到:正常对照组肺小血管壁未见CTGF蛋白表达;而试验组的肺小血管壁除明显增厚、内皮细胞肿胀肥大、中层平滑肌增生肥厚、细胞外基质成分增多外，血管组织内可见不同程度的CTGF蛋白沉积，尤其以血管外膜纤维组织居多，血管内皮细胞略有表达，中膜平滑肌细胞则未见表达。CTGF是一种重要的致纤维化因子，刺激成纤维细胞增殖、细胞外基质合成是其重要作用;CTGF在正常血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）中几乎不存在，但在粥样硬化斑块内未增殖的平滑肌细胞中呈过度表达［7］ ，人平滑肌细胞系中CTGF瞬间的过表达会导致其凋亡加速［8］ ，因而推测CTGF仅存在于未增殖或近凋亡的VSMC中。而本实验中低氧性肺血管重建的VSMC呈高度增殖状态，可能是血管中膜未见CTGF表达的原因。CTGF促进中层平滑肌增生可能通过旁分泌路径起作用。

    所以作者认为，CTGF在大鼠低氧性肺动脉高压和 肺血管重建过程中起到一定作用，但其在人体是否有相同表现，其作用的信号转导途径、作用发生的阶段、早期干预能否预防肺动脉高压和肺血管重建的发生以及如何延缓其进展尚待进一步研究。

　　［］
     
　　［1］DURMOWICZ A G，STENMARK K R.Mechanisms of structural remodeling in chronic pulmonary hypertension［J］.Pediatr Rev，1999，20（11）:91.102.

    ［2］薛全福，谢剑鸣，胡长贵，等.常压低氧性大鼠肺动脉高压模型的建立［J］.中华结核和呼吸杂志，1989，12（6）:350.352.

　　［3］KONDO S，KUBOTA S，SHIMO T，et al.Connective tissue growth factor increased by hypoxia may initiate angiogenesis in col-laboration with matrix metalloproteinases［J］.Carcinogenesis，2002，23（5）:769.776.

    ［4］HISHIKAWA K，OEMAR B S，NAKAKI T.Static pressure regu-lates connective tissue growth factor expression in human mesangial cells［J］.J Biol Chem，2001，276（20）:16797.16803.

    ［5］SHIMO T，KUBOTA S，KONDO S，et al.Connective tissue growth factor as a major angiogenic agent that is induced by hy-poxia in a human breast cancer cell line［J］.Cancer Lett，2001，174（1）:57.64.

    ［6］SUZUMA K，NARUSE K，SUZUMA I，et al.Vascular endothelial growth factor induces expression of connective tissue growth factor via KDR，Flt1，and phosphatidylinositol3-kinase-akt-dependent pathways in retinal vascular cells ［J］.J Biol Chem，2000，275（52）:40725.40731.

    ［7］OEMAR B S，LUSCHER T F.Connective tissue growth factor.Friend or foe?［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997，17（8）:1483.1489.

    ［8］HISHIKAWA K，NAKAKI T，FUJII T.Transforming growth fac-tor-beta（1）induces apoptosis via connective tissue growth factor in human aortic smooth muscle cells［J］.Eur J Pharmacol，1999，385（2.3）:287.290.